张思雨， 王瀚宇， 朱方舟， 顾也博， 贾鑫明
| 【作者机构】 | 同济大学医学院 |
| 【分 类 号】 | R563 |
| 【基 金】 | 国家自然基金面上项目(82371777) 同济大学自主原创基础研究项目基金(22120240340) |
·基础研究·
烟曲霉(Aspergillus fumigatus,A. fumigatus)是一种常见的机会性致病真菌,其孢子在环境中广泛分布,主要通过呼吸道定植引发肺部感染。流行病学数据显示,肺部真菌感染病例中曲霉菌感染最为常见(37.9%～57.0%),截至2018年,中国侵袭性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis,IPA)的患者基数已超过16万例[1]。IPA在免疫抑制患者人群中呈高发态势,包括血液系统恶性肿瘤、器官移植受者或长期使用糖皮质激素者,感染率显著升高,全球的IPA死亡率为39%～100%[2-3]。
γδT细胞是T淋巴细胞中的特殊亚群,具有由γ链和δ链组成的独特TCRγδ受体,兼具快速免疫应答与适应性免疫记忆的双重特性[4],作为固有免疫和适应性免疫之间的桥梁,在肿瘤免疫监视和抗病原体感染中发挥着重要的作用[5]。γδT细胞分布于人体的多种组织器官中,肺组织是γδT细胞的重要分布区,其Vγ1和Vγ4亚群占比达60%～80%[6],通过分泌IFN-γ、IL-17A、IL-4等细胞因子构建早期免疫防线,并介导巨噬细胞、中性粒细胞等效应细胞的募集[7-8]。在曲霉感染中,巨噬细胞的主要作用是吞噬烟曲霉孢子,通过氧化或非氧化机制杀伤孢子[9],或通过免疫调节招募其他免疫细胞及激活适应性免疫反应[10];中性粒细胞能通过吞噬曲霉菌菌丝和孢子,直接杀伤病原体[11-12],其释放的中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)能起到抑制菌丝生长的作用[12-13]。本研究通过构建小鼠肺烟曲霉感染模型和体外γδT细胞烟曲霉刺激模型,探究γδT细胞在肺烟曲霉感染过程中的免疫调控作用机制。
C57BL/6J小鼠(雄性,6～8周龄)购置于江苏集萃药康生物科技有限公司;TCRδ基因敲除(TCRδ KO)小鼠由暨南大学生物医学转化研究院尹芝南教授课题组惠赠。烟曲霉菌株AF293为本实验室保藏菌种;沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA培养基)购自北京索莱宝公司;胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;RPMI-1640培养基、DMEM培养基、链霉素-青霉素双抗购自南京维森特公司;IL-17A、IFN-γ及IL-4 ELISA检测试剂盒购自eBioscience公司;流式抗体(CD3ε、TCRγδ、CD11b、Ly6G、F4/80)及流式细胞仪(BD FACSCantoTM Ⅱ)均购自BD Biosciences公司。
将AF293菌株接种于SDA平板,37 ℃恒温培养7 d,以含0.1% Tween-80的无菌PBS轻柔冲洗琼脂表面,收集分生孢子悬液,经70 μm细胞滤网过滤去除菌丝,获得静息态孢子。将静息态孢子接种于RPMI-1640基础培养基(含10% FBS)中,37 ℃、5% CO2条件下孵育6 h,诱导孢子膨胀后用于体外实验。
使用异氟烷麻醉小鼠后,将其垂直固定并悬挂于泡沫板上,用镊子拉出舌头,用移液枪向气管缓慢注入30 μL孢子悬液(包含4×107个烟曲霉孢子),对照组接种无菌PBS溶液。观察小鼠反应,待其苏醒后放回笼中。
在无菌条件下取小鼠肺组织,剪碎后将组织转入含有1 mg/mL胶原酶Ⅳ和0.1 mg/mL DNase Ⅰ的1640培养基中,37 ℃摇床消化45 min,随后用70 μm细胞筛网过滤,收集滤液,400×g离心5 min后,去上清液;向细胞沉淀中加入裂红液裂解红细胞5 min,结束后加入10 mL含1% FBS的PBS(以下称为IB)终止,400×g离心5 min后,去上清液;用IB重悬细胞。400×g离心5 min后,去上清液;用含有刺激阻断剂的1640完全培养基重悬细胞,铺至24孔板内,37 ℃下刺激阻断5～6 h。结束后收集细胞,IB洗涤2～3次,加入100 μL配制好的含有带荧光标签的流式抗体的染色液,4 ℃染色30 min。IB洗涤2～3次后加入200 μL破膜固定液在4 ℃固定破膜20 min,IB洗涤后加入100 μL胞内蛋白染色液,4 ℃染色1 h,染色结束后用IB洗涤,用4%多聚甲醛重悬固定细胞。200目铁丝网过滤后转移至流式管内,加入计数微球后流式仪上机测试。
在无菌条件下取出WT小鼠脾脏置于PBS中,使用70 μm细胞滤网进行过滤,收集细胞悬液,300×g离心5 min后,去上清液,裂解红细胞。使用PBS洗涤细胞两次后用细胞计数仪计数活细胞,将细胞浓度调整至1×107个/mL。用1 mL注射器吸取200 μL细胞悬液尾静脉注射入TCRδ-/-小鼠体内,在过继转输后10 d进行烟曲霉感染。
取小鼠脾脏置于1640培养基中,过40 μm滤网,将滤液400×g离心7 min后,去上清液,使用1～2 mL RBC裂解红细胞,5 min后用10 mL 1640培养基终止裂红,400×g离心7 min后,去上清液,接着使用1640完全培养基将脾细胞重悬至2.5×106个/mL,加入1 μg/mL anti-CD28和2 ng/mL mIL-2。向提前用anti-TCRδ包被好的48孔板每孔加入500 μL细胞悬液,置于37 ℃培养箱内培养。
48 h后收集每孔细胞,400×g离心7 min后,去上清液。然后用新鲜的1640完全培养基重悬后,加入2 ng/mL的mIL-2,每孔500 μL进行铺板,置于37 ℃培养基进行培养。此后每1～1.5 d重复上述步骤至第6天,即可对γδT细胞进行收集。
扩增的γδT细胞(6×105个/mL)接种于12孔板,分别按感染复数(MOI为1和5)加入紫外灭活的膨胀态孢子悬液,置于37 ℃培养箱中孵育。
在无菌条件下取待测小鼠肺组织,称取重量后置于提前加入1 mL PBS及组织研磨珠的2 mL EP管中,研磨成肺组织匀浆液;研磨完毕后使用PBS将匀浆液稀释到10、100、1 000倍,使用涂布珠均匀涂布于SDA平板上,倒置平板置于30 ℃培养箱培养24 h,收取平板计数菌落数量,乘以稀释倍数,得到每毫升样品中的cfu数量,再除以样品重量,得到每克肺组织的cfu数量(cfu/g)。
小鼠经颈椎脱臼法处死后,立即使用20 mL无菌PBS经左心室灌注,直至右心房流出液澄清,以充分清除肺循环血液。随后完整摘取肺组织,迅速浸入4%多聚甲醛固定液中,于4 ℃条件下固定24 h。固定完成后,委托武汉赛维尔公司进行免疫荧光染色分析。采用抗Cx3cr1抗体标记巨噬细胞,DAPI染液标记细胞核。
数据以均值±标准误
表示,使用GraphPad Prism 9.0进行t检验(两组)或单因素方差分析(多组)。P<0.05为差异具有统计学意义。
为了明确烟曲霉感染对肺组织γδT细胞亚群的影响,本研究采用压舌法建立烟曲霉标准株AF293肺部感染模型(C57BL/6J野生型小鼠),以未感染组(0 d)作为对照,分别在感染后2、4 d通过流式细胞术动态分析肺组织γδT细胞亚群分布特征。结果显示,γδT细胞在感染后4 d显著增加,TCRγδ+CD3+γδT细胞比例显著升高(P=0.000 1),提示烟曲霉感染驱动γδT细胞向肺组织募集(图1A、C)。Vγ1+亚群在感染后4 d成为扩增的主要亚群(图1B、D)(P<0.000 1),而Vγ4+亚群的比例则没有显著差异,且其总体比例显著低于Vγ1+亚群(图1E)。
图1 烟曲霉感染诱导肺组织γδT细胞亚群动态扩增与Vγ1+亚群优势富集
Fig.1 Induction of dynamic expansion of lung tissue γδT cell subsets and dominant enrichment of Vγ1+ subsets by A. fumigatus infection
A、B:采用流式细胞术对烟曲霉标准株AF293肺部感染小鼠模型在感染后0(对照)、2、4 d的肺组织免疫细胞表型和数量进行动态监测;C:TCRγδ+CD3+γδT细胞比例定量分析;D:Vγ1+亚群比例定量分析;E:Vγ4+亚群比例定量分析;***P<0.001,****P<0.000 1。
为了明确γδT细胞在烟曲霉感染中的调控作用,本研究采用TCRδ基因缺陷(TCRδ-/-)小鼠模型,通过压舌接种烟曲霉标准株AF293,动态分析肺组织真菌清除效率及γδT细胞的功能机制(图2A、B)。结果显示,TCRδ-/-小鼠感染后4、6 d肺组织菌落形成单位(cfu)较野生型(WT)显著降低(4 d:P=0.011 2;6 d:P=0.043 4),表明γδT细胞缺陷显著增强宿主抗真菌能力,提示γδT细胞抑制宿主清除烟曲霉的固有免疫应答(图2A)。过继转输WT小鼠全脾细胞至TCRδ-/-小鼠后,肺真菌负荷显著恢复(P=0.000 1),直接证实γδT细胞是介导免疫抑制的关键效应细胞(图2B)。
图2 TCRδ基因缺陷显著降低肺部烟曲霉感染负荷
Fig.2 TCRδ gene deficiency significantly reduces the pulmonary fungi burden of A. fumigatus infection
A:采用cfu计数法对TCRδ-/-小鼠在烟曲霉感染后4、6 d的肺组织真菌载量进行定量分析;B:通过过继转移实验,将WT小鼠的全脾细胞移植至TCRδ-/-小鼠体内,随后建立烟曲霉感染模型,并于感染后4 d对受体小鼠肺组织的感染负荷进行定量分析;*P<0.05,***P<0.001。
为解析γδT细胞在烟曲霉感染中的作用机制,通过体外实验建立了烟曲霉膨胀态孢子直接刺激模型。采用不同感染梯度(MOI为5)对γδT细胞进行刺激(3、6、24 h),通过ELISA技术动态监测关键细胞因子(IFN-γ、IL-17A、IL-4)的分泌特征。结果显示,在基础培养条件下,γδT细胞自发性分泌的IFN-γ在6 h(P=0.024 2)和24 h(P=0.024 3)显著高于Naïve对照组,提示静息态γδT细胞具有IFN-γ的基础分泌特性。然而,经烟曲霉孢子刺激后,不同感染梯度下γδT细胞产生的IFN-γ均受到显著抑制(6 h:P=0.049;24 h:P=0.048 7)(图3A)。然而,不同感染梯度下γδT细胞产生的IL-17A和IL-4水平未显示明显差异(图3B、C),这些发现首次证实烟曲霉膨胀态孢子可通过直接作用调控γδT细胞的关键效应分子IFN-γ分泌,为阐释烟曲霉通过干扰γδT细胞功能实现免疫逃逸提供了新的实验依据。
图3 烟曲霉孢子刺激通过抑制γδT细胞产生IFN-γ介导免疫逃逸
Fig.3 A. fumigatus conidia stimulation mediates immune escape by inhibiting the production of interferon(IFN)-γ by γδT cells
A:采用ELISA检测烟曲霉孢子在不同感染复数(MOI为1和5)条件下,分别感染烟曲霉3、6和24 h后,体外培养的γδT细胞中IFN-γ的分泌水平;B:ELISA检测IL-17A的分泌水平;C:ELISA检测IL-4的分泌水平;*P<0.05
