邢忠刚， 贾王雅， 李剑， 季莉莉， 徐红， 孙毅
| 【作者机构】 | 同济大学医学院； 上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，中药新资源与品质评价国家中医药管理局重点研究室，上海市复方中药重点实验室； 中国药科大学药剂学教研室； 金陵药业股份有限公司技术中心 |
| 【分 类 号】 | R575.5 |
| 【基 金】 | 国家自然科学基金重点项目(82030035) 国家自然科学基金面上项目(82173958)国家重点研发计划“中医药现代化”重点专项资助项目(2024YFC3506600) |
·基础研究·
代谢功能障碍相关脂肪性肝病(metabolic dysfunction-associated fatty liver disease,MAFLD)曾命名为非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),是一种与代谢紊乱紧密相关的肝脏疾病,早期表现为单纯性脂肪病变,后期发展成为脂肪性肝炎,并可能进一步发展为肝纤维化、肝硬化乃至肝癌[1]。MAFLD发病率逐年增高,流行病学调查显示截至2022年全球成年人平均患病率高达32.0%,然而目前临床仍缺乏有效治疗的药物[2]。
过氧化物酶体增殖物激活受体家族(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)为小分子配体激活型受体,在调控能量代谢过程中发挥关键作用。其中,PPARα在肝脏中高表达,作为转录因子调控脂肪酸氧化过程中关键酶的表达,是MAFLD治疗的重要靶点[3]。目前,Saroglitazar作为PPARα/γ双激动剂于印度被批准用于治疗MAFLD[4],此外Lanifibranor、Chiglitazar等多种PPARs激动剂正处于临床研究阶段[5]。
木犀草苷(luteolin-7-O-glucoside,LUT-7G)以及其脱糖苷后化合物木犀草素(luteolin,LUT)均是一种在植物中广泛存在的黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、降脂等多种生物活性[6]。已有研究发现,LUT-7G及LUT能够通过激活肝脏中PPARα信号通路,增加脂肪酸氧化能力,改善代谢紊乱类疾病[7-8]。然而木犀草苷激活PPARα信号通路的作用机制尚未明确。
基于此,本研究基于木犀草苷对高脂饲料(high fat diet,HFD)诱导小鼠MAFLD的药效实验,探究木犀草苷激活PPARα信号通路的作用机制,进一步明确PPARα在木犀草苷发挥药效中的重要作用,阐明其作用机制,为其临床应用转化提供实验依据。
木犀草苷(JOT-10089)购买于成都普菲德对照品科技有限公司。试剂盒信息如下:谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活力检测试剂盒;甘油三酯(triglyceride,TG)、游离脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)及总胆固醇(total cholesterol,TC)含量检测试剂盒购买于南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量试剂盒购买于江苏圣尔生物科技有限公司;胞质胞核抽提试剂盒购买于上海碧云天生物技术股份有限公司。抗体信息如下:PPARα购买于美国Santa生物技术公司;actin购买于杭州华安生物技术有限公司;LaminB1购买于上海埃必威生物技术有限公司;肉碱棕榈酰转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,CPT1A)购买于赛信通(上海)生物试剂有限公司;山羊二抗(兔及鼠)抗购买于美国Jackson公司。实时定量反转录聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription,RT-PCR)相关试剂信息如下:TRIzol、SYBR Green试剂及反转录酶购买于翌圣生物科技股份有限公司。其他试剂信息如下:微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)专用毛细管购买于诺坦普科技(北京)有限公司;PPARα-EGFP质粒购买于武汉淼灵生物科技有限公司;Lipofectamine3000转染试剂购买于美国赛默飞世尔科技公司;GW6471购买于美国Selleck化学公司;60%HFD购买于美国Research Diets饲料公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)购买于大连美仑生物技术有限公司;BODIPY及Hoechst 33342染料分别购买于美国赛默飞世尔科技公司及上海碧云天生物技术股份有限公司。
人肝细胞系HepaRG细胞及HEK-293T细胞购自中国科学院典型培养物保藏中心细胞库(中国上海)。
C57BL/6J雄性小鼠(6周龄,体重18～20 g)20只购自中国科学院上海实验动物中心,饲养于上海中医药大学实验动物中心(SYXK(沪)2020-0009)。饲养环境维持在标准室温[(22±1) ℃]、相对湿度[(65±5)%],并实行12 h光照/12 h黑暗的循环模式。
所有动物随机分为低脂对照组(normal control diet,NCD)及高脂饲料造模组,分别连续给予普通低脂饲料及高脂饲料连续喂养12周,8周后造模组根据体重均匀分为模型组(HFD)(n=5)、木犀草苷低剂量干预组:HFD+LUT-7G(30 mg/kg)(n=5)及木犀草苷高剂量干预组:HFD+LUT-7G(60 mg/kg)(n=5);木犀草苷给药干预组灌胃给予对应剂量药物,给药体积为0.2 mL/kg,其他组别灌胃给予相等体积的生理盐水,每日1次,连续4周。实验结束后麻醉处死小鼠,取血液及肝脏等用于后续实验(动物伦理号:PZSHUTCM2312010003)。
取小鼠血清至冰上,分别取5 μL小鼠血清与ALT及AST基质液在37 ℃条件下共孵育30 min,随后加入20 μL 2,4-二硝基苯肼液在37 ℃条件下共孵育20 min以终止反应,加入0.4 mol/L氢氧化钠液200 μL使反应生成的苯腙在碱性条件下呈红棕色,15 min后于505 nm波长下读取吸光度,将绝对吸光度值(测定孔吸光度-空白孔吸光度)带入标准曲线以计算样本中ALT及AST的酶活力。
取2.5 μL小鼠血清样本在含250 μL TG及TC的试剂盒中共孵育10 min后,于500 nm波长下测定各孔吸光度值,通过与对照品比对计算样本中TG及TC含量。取小鼠肝脏样本,加入9倍体积的无水乙醇在冰水浴条件下得到匀浆液,2 500×g离心10 min后,取上清液待测,具体步骤同上述血清样本。
取4 μL小鼠血清与试剂盒中试剂一于37 ℃条件下孵育5 min,血清中游离脂肪酸被反应生成H2O2,随后加入试剂二(过氧化物酶),37 ℃条件下孵育5 min以反应生成有色底物,采用空白及校准品两点校准的方法计算样本中NEFA含量。取小鼠肝脏组织,加入9倍体积的生理盐水在冰水浴条件下得到匀浆液,2 500×g离心10 min,取上清液待测,具体步骤同上述血清样本。
取各组小鼠肝小叶固定于4%多聚甲醛中,石蜡包埋后切成5 μm薄片,随后将肝组织切片进行脱蜡与水化处理,分别与苏木精染料及伊红染料共同孵育,随后进行脱水及封片;石蜡包埋后切的薄片与F4/80及Ly6G一抗在4 ℃条件下孵育过夜,清洗后加入二抗室温孵育1 h,随后加入显色剂使二抗显色,并再次进行苏木精染色,最后进行脱水与封片。同样取固定在4%多聚甲醛中小鼠肝脏组织,使用冰冻切片切成薄片,使用油红O染料对肝脏中脂质进行染色,最后进行封片。上述所有切片在扫片机上进行扫描保存。
据各组小鼠肝脏HE染色的病理切片,根据评分准则[9],对各组的小鼠肝脏的脂肪变性、肝细胞气球样变以及小叶炎症程度进行评分,各项总分即为NAS。
小鼠肝脏及细胞样本按照胞质胞核蛋白制备试剂盒操作,分别得到小鼠肝脏及细胞的胞质及胞核蛋白样本,各组样本加入SDS-PAGE凝胶孔,电泳分离后将目标蛋白转膜至PVDF,使用牛奶封闭1 h后,与目标蛋白一抗在4 ℃条件下孵育过夜,洗膜后加入特异性二抗室温下孵育1 h,洗脱后加入化学发光显影液,使用蛋白显影仪进行成像,并使用ImageJ对灰度进行扫描并统计。
小鼠肝脏及细胞基因样本使用TRIzol法进行mRNA抽提,配制反转录体系将基因反转录为cDNA,随后与SYBR green荧光染料以及引物配制成反应体系,在实时荧光定量PCR仪(QuantStudio 6)上进行扩增。使用2-ΔΔCt方法,以actin为内参,计算各组样本中目标基因的相对表达量。引物序列见表1。
表1 引物序列
Tab.1 The sequence of primers
基因名称序列(5′→3′)m-actinTTCGTTGCCGGTCCACACCCGCTTTGCACATGCCGGAGCCm-IL-1bTCGCAGCAGCACATCAA-CAAGAGTGCTCATGTCCTCATCCTG-GAAGGm-IL-6CCAAGAGATAAGCTGGAGTCA-CACGCACTAGGTTTGCCGAGTAm-Cpt1aTATGGTCAAGGTCT-TCTCGGGTCGAGTGCTGTCATGCGTTG-GAAGTCTCm-AcadlTTCAGATGCCCAGTATTTTGCCTGTGAGTTCATGTTTGm-AcadmTAACATACTCGTCACCCTTCATGCCTGTGATTCTTGCTm-AcadvlGATTCCTGTCCTCCGTCTCGGCTCTGCAAGGCTGTATm-Acox1CAGACCCTGAAGAAATCATGT-GGCAGGAACATGCCCAAGTGAAGm-Cyp4a10TCAGTCTATTTCTGGTGCTGTTCGAGCTCCTTGTCCTTCAGATGGTm-Cyp4a14TCAGTCTATTTCTGGTGCTGTTCGAGCTCCTTGTCCTTCAGATGGTh-ACTINGGCACCACACCTTCTACAAT-GAGCGATAGCACAGCCTGGATAG-CAACGh-CPT1ATGTGTCGTACATCCTTGTGGGAGGCCTTGTTTCCATATGCTGAh-ACADLTGCTCACCTACAGACAGTGCTGCCCAATATTTCGCCATGCh-ACADMCGGGGTTCGGGCGATGGGTTCACGTTGTCGATTGGCh-ACOX1GAAAAGCTGGAGACTCCCTCGTCATGTTCTCTGGGGAATGGCh-CYP4A11CAAAAATGGAATCCACCTGCGTCAGACAGAAAACAGGATAT-GGGCh-CYP4A22CTTCCTGACCCCCACTCCTATAAGGTGAGAGAGAGAAGGGCA
从蛋白质数据库(https:∥www.rcsb.org)获取PPARα的3D结构(PBD:3ET1);在PubChem上下载LUT-7G的结构式,并为其分配电荷、生成构象以优化其几何结构;使用AutoDock预测二者结合构象,计算结合相互作用能量,最后使用PyMOL进行可视化作图。
在HEK-293T细胞达到70%～90%的融合度时,根据Lipofectamine3000转染试剂说明书按照比例配制转染复合物,随后缓慢加入细胞培养基中,24 h后收集细胞进行后续实验。
收取转染PPARα-EGFP质粒的HEK-293T细胞,加入裂解液,超声破碎,离心后得到目标蛋白溶液,质检(荧光强度以及样本是否聚团)合格后,与不同浓度的LUT-7G室温下共孵育10 min,随后通过毛细管吸取样品并上机进行实验。使用MO.Affinity Analysis软件进行数据分析,拟合PPARɑ-EGFP蛋白与LUT-7G的亲和力值。
收集HepaRG细胞后,经超声破碎处理,加入LUT-7G(终浓度为25 μmol/L)及等体积的DMSO室温共孵育1 h。随后,将样本置于不同温度下加热处理,处理完成后,加入2×上样缓冲液后于99 ℃条件下煮样10 min。通过蛋白电泳检测样本中PPARα及内参蛋白actin的含量,利用GraphPad Prism 10.3.1软件绘制蛋白热稳定曲线。
取对数生长期的HepaRG细胞,铺板于6孔板中,待细胞贴壁后,将培养基中血清更换为1%BSA,细胞被分为以下6个组别:1%BSA组、NEFA(0.5 mmol/L)组、NEFA+LUT-7G(25 μmol/L)组、GW6471+1%BSA组、GW6471+NEFA(0.5 mmol/L)组、GW6471+NEFA+LUT-7G(25 μmol/L)组,24 h后收集细胞用于BODIPY荧光染色。
取给药干预后的各组细胞,使用4%多聚甲醛进行固定后,在PBS水中加入BODIPY及Hoechst 33342染料,避光孵育30 min后,使用PBS清洗细胞2次,后将细胞浸泡在PBS溶液中,在荧光显微镜下观察并拍摄荧光照片。
数据采用IBM SPSS Statistics 26.0进行统计分析。实验数据以均值±标准误
表示。多组数据比较时,数据进行单因素方差分析进行方差齐性检验,当方差齐则使用方差分析(LSD检验);当方差不齐则使用非参数检验进行二个独立样本的秩和检验;两组数据比较时,数据符合正态分布则使用配对样本t检验,不符合正态分布则选用非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
检测各组小鼠血清中ALT及AST的酶活力,结果显示各组差异无统计学意义(图1A)。各组小鼠肝脏直观图及HE染色结果显示,NCD组小鼠肝脏呈红褐色,肝细胞排列整齐,而HFD组小鼠肝脏则呈现奶油白色,存在大量的脂肪空泡,肝细胞肿胀,出现气球样变,伴随少量炎性细胞浸润,给予LUT-7G(30、60 mg/kg)干预4周后,HFD小鼠肝脏恢复红褐色,脂肪空泡显著减少,肝细胞排列整齐(图1B)。进一步对各组小鼠肝脏切片进行NAS评分,结果显示,与NCD组相比,HFD组小鼠NAS评分大于5(P<0.05),提示肝脏到达NASH阶段,而给予LUT(30、60 mg/kg)干预治疗后NAS评分显著降低(P<0.05)(图1C)。以上结果表明LUT-7G能够改善HFD饮食诱导的MAFLD小鼠肝脏脂质变性及肝损伤。
图1 LUT-7G改善HFD诱导MAFLD小鼠肝损伤
Fig.1 LUT-7G alleviated hepatic injury in metabolic dysfunction-associated fatty liver disease(MAFLD) mice fed with high fat diet(HFD)
A:血清ALT及AST酶活力(n=5);B:肝脏直观图及HE染色结果(n=3);C:NAS评分(n=3);与NCD比较,*P<0.05;与HFD比较,#P<0.05。
血液及肝脏中大量的脂质堆积是HFD诱导小鼠MAFLD肝脏病变的重要特征之一。小鼠肝脏中脂质的过量堆积,诱导氧化反应的发生,产生大量活性氧,进而损伤细胞功能,导致肝脏炎症的发生,加剧MAFLD的病程[10]。实验结果(图2A～C)显示,HFD组小鼠血清中NEFA、TG及TC的含量较NCD组显著升高,给药LUT-7G(30、60 mg/kg)干预后呈现显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。进一步检测肝脏中脂质含量,结果显示LUT-7G(30、60 mg/kg)给药干预能够剂量依赖性降低HFD小鼠肝脏中TG及NEFA含量(P<0.05,P<0.01)(图2D、E),油红O染色切片(图2F)更直观显示这一结果。以上结果说明,LUT-7G(30、60 mg/kg)能够减少HFD小鼠血清及肝脏中脂质堆积含量,发挥改善MAFLD的药效。
图2 LUT-7G降低HFD诱导MAFLD小鼠血清及肝脏中脂质堆积
Fig.2 LUT-7G attenuated lipid accumulation in the serum and liver of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease(MAFLD) mice fed with high fat diet(HFD)
A:血清中NEFA含量(n=5);B:血清中TG含量(n=5);C:血清中TC量(n=5);D:肝脏中NEFA含量(n=5);E:肝脏中TG含量(n=5);F:小鼠肝脏油红O染色结果(n=3);与NCD比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与HFD比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。
对各组小鼠肝脏炎症情况进行分析,分别对小鼠肝脏组织进行F4/80及Ly6G免疫组化染色以表征各组小鼠肝脏中炎症相关巨噬细胞及中性粒细胞浸润情况。结果显示,与NCD组小鼠相比,HFD组小鼠肝脏中炎性巨噬细胞(F4/80+)及中性粒细胞(Ly6G+)浸润明显增多,LUT-7G(30、60 mg/kg)治疗后能够显著减少炎性浸润(图3A)。进一步检测各组小鼠肝脏中炎症相关基因表达水平,包括IL-1b及IL-6,结果同样显示HFD小鼠肝脏中升高的IL-1b及IL-6基因表达水平在LUT-7G(30、60 mg/kg)治疗后降低(图3B)(P<0.05)。上述结果提示,LUT-7G对HFD小鼠出现的肝脏炎症反应有显著的改善作用。
图3 LUT-7G改善HFD诱导MAFLD小鼠炎性损伤
Fig.3 LUT-7G reduced inflammatory infiltration in the liver of metabolic dysfunction-associated fatty liver disease(MAFLD) mice fed with high fat diet(HFD)
A:小鼠肝脏F4/80及LY6G组化染色结果(n=3);B:小鼠肝脏中炎症因子IL-1b及IL-6的基因水平(n=4);与NCD比较,*P<0.05;与HFD比较,#P<0.05。
PPARα作为核受体超家族中的一种配体激活型转录因子,在肝脏中高表达,并在调控肝脏脂质代谢中发挥重要作用。前期调研文献显示,木犀草苷能够激活肝脏小鼠PPARα信号通路[7],因此在体内动物实验及体外细胞实验上进行验证。结果显示,LUT-7G(30、60 mg/kg)能够增加HFD小鼠肝脏中PPARα的核转位(P<0.001),并且显著上调PPARα下游脂肪酸β氧化限速酶CPT1A的蛋白及基因表达(P<0.05)(图4A、B),同时显著增加其他脂肪酸氧化相关基因的表达,包括短链酰基辅酶A脱氢酶(Acads)(P<0.05)、中链酰基辅酶A脱氢酶(Acadm)(P<0.05,P<0.001)、超长链酰基辅酶A脱氢酶(Acadvl)(P<0.05)、酰基辅酶A氧化酶1(Acox1)(P<0.05,P<0.01)、细胞色素P450家族4亚家族A(Cyp4a)成员10(Cyp4a10)(P<0.01)及14(Cyp4a14)(P<0.05)(图4B)。体外肝细胞脂质堆积模型同样验证发现,LUT-7G(10、25 μmol/L)能够同样促进PPARα的核转位(P<0.05),而对胞质中PPARα的含量无显著影响(图4C),同时给药能够显著上调脂肪酸β氧化限速酶CPT1A的蛋白及基因表达(P<0.05)(图4C、D),以及上调其他参与脂肪酸β氧化的关键因子的基因表达,包括ACOX1(P<0.05)、ACADS(P<0.05)、ACADM(P<0.05)、ACADVL(P<0.05)、CYP4A11(P<0.05)、CYP4A22(P<0.05)(图4D)。上述结果显示,LUT-7G通过促进肝脏中PPARα核转位,增加脂肪酸氧化消耗过度堆积的脂质,从而发挥降低HFD小鼠肝脏中脂质堆积的作用,缓解肝脏炎症及肝损伤的药效。
图4 LUT-7G体内外激活PPARɑ信号通路
Fig.4 LUT-7G activated peroxisome proliferator-activated receptor α(PPARɑ) signaling pathway both in vivo and in vitro
A:小鼠肝脏中PPARα入核及CPT1A蛋白表达情况,左边:蛋白条带图;右边:统计图(n=3);B:小鼠肝脏中Cpt1a、Acads、Acadm、Acadvl、Acox1、Cyp4a10及Cyp4a14基因表达(n=4);C:HepaRG细胞中PPARα核转位及CPT1A蛋白表达情况,左边:蛋白条带图;右边:统计图(n=3);D:HepaRG细胞中CPT1A、ACOX1、ACADS、ACADM、ACADVL、CYP4A11、CYP4A22的基因表达情况(n=4);与NCD组或1%BSA组比较,*P<0.05,**P<0.01;与HFD组或NEFA组比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。
PPARα为典型的配体依赖性转录因子,其蛋白结构上具有小分子配体结合区,通过与该区域结合能够促进PPARα入核,转录调控一系列脂肪酸氧化相关因子的基因表达[11]。因此,我们推测LUT-7G与PPARα是否存在直接的结合作用。分子对接结果(图5A)显示,木犀草苷与PPARα(PDB ID:3ET1)分别在谷氨酸-369及赖氨酸-222存在氢键结合,与谷氨酸-369及精氨酸-226存在π-阳离子相互作用,在甲硫氨酸-363地方可能存在π-烷基相互作用,进一步模拟估算二者的结合自由能为-29.288 kJ/mol,提示二者具有潜在的结合。MST实验结果(图5B)显示,随着LUT-7G浓度的升高,荧光强度增强,拟合Kd值为0.28 μmol/L,且信噪比(S/N)为24.0,提示二者确实存在直接相互作用。进一步采用CETSA进行验证,结果显示(图5C)细胞裂解液与LUT-7G(25 μmol/L)共孵育后,PPARα随着时间降解与溶媒对照组相比减缓,并在64 ℃有显著差异(P<0.05),而对照组(Actin)则无显著性改变。以上结果显示,LUT-7G能够与PPARα直接结合,进而促进其核转位。
图5 LUT-7G直接靶向结合PPARα
Fig.5 LUT-7G directly binds with peroxisome proliferator-activated receptor α(PPARα)
A:分子对接实验,上面:二维可视化图;下面:对接亲和力值;B:MST曲线;C:CETSA结果,上面为蛋白条带图,下面为拟合曲线;n=3,*P<0.05。
上述实验结果显示,LUT-7G能够直接靶向结合PPARα发挥降脂作用。然而,PPARα在其降脂活性中是否具有重要活性尚未可知。GW6471作为PPARα的拮抗剂,能够与小分子竞争性结合PPARα,从而抑制其活性。因此本研究探究GW6471是否能够逆转LUT-7G的降脂活性。
BODIPY荧光染色实验结果显示(图6A、B),LUT-7G体外能够降低(0.5 mmol/L)NEFA诱导下HepaRG中脂质堆积(P<0.05),给予GW6471处理后HepaRG细胞中脂质堆积显著增加(P<0.05),而给予LUT-7G后无显著改善,上述结果说明PPARα是LUT-7G发挥降脂活性的关键靶点。
图6 PPARα是LUT-7G发挥降脂作用的关键靶点
Fig.6 Peroxisome proliferator-activated receptor α(PPARα) is the main target of LUT-7G on the lipid-lowering effects
A:免疫荧光图;B:统计图;n=3,与1%BSA组比较,*P<0.05;与NEFA组比较,#P<0.05;GW6471与DMSO比较,&P<0.05;ns表示差异无统计学意义。
MAFLD是一种与代谢紊乱密切相关的疾病,其发病机制复杂多变,涉及遗传、饮食、环境等多种因素,伴随肝脏发生脂毒性、胰岛素抵抗、慢性炎症等多种反应。越来越多的研究证明,肠道、肌肉及脂肪组织通过释放胆汁酸、脂多糖、脂肪因子及和肌肉因子等多种机制共同诱导了MAFLD的发生[12]。其发病机制的复杂性也决定了药物研发的难度。截至2025年,FDA批准了临床上用于治疗MASH的第一款药物resmetirom,且疗效更偏向于肝纤维化阶段[13]。除此之外,包括GLP-1受体激动(Semaglutide)、FGF21类似物(Pegozafermin、Efruxifermin)以及泛PPAR激动剂(Lanifibranor)已经处于三期临床实验[12],并且PPARα/γ双激动剂已经由印度批准上市[14],说明PPARs激动剂在治疗MAFLD具有重要潜在价值。
PPARs家族是一类核受体转录因子,由PPARα、PPARβ/δ及PPARγ这3种亚型组成,其中PPARα高表达于肝脏,PPARγ高表达于脂肪组织。其结构由A～F这6个主要区域构成,其中A/B区域包含激活功能区1(activation function-1,AF-1),用于调节基因转录;C区域为DNA结合区域(DNA-binding domain,DBD),负责特异性识别下游因子启动子中的过氧化物酶体增殖反应元件(peroxisome proliferator response element,PPRE),以启动转录;D区域为铰链区,主要涉及蛋白质的翻译后修饰,包括磷酸化及泛素化等;E、F区域为小分子结合区域(ligand-binding domain,LBD)及AF-2区,其中LBD区域负责与小分子配体结合,从而激活或者抑制转录,而AF-2区域用于结合共激活因子[11]。人体内源性配体激动剂,例如:游离脂肪酸、二十烷类衍生物等[11],以及天然界中的虾青素、呋喃酮、丁内酯I等被报道为PPARs活性配体[15],当该区域招募到小分子配体并被激活后,能够改变AF-2的构型并招募共激活因子,从而与视黄醇(retinoid X receptor,RXR)形成异物二聚体结合到目标基因的PPRE反应元件上,从而促进基因的转录[11]。
木犀草苷和木犀草素是广泛存在于自然界蔬菜水果及中药的黄酮类化合物。前期研究发现其能够激活PPARα/γ信号通路改善MAFLD[7-8],并且作为PPARγ的配体激动剂,通过抑制自噬改善阿尔茨海默病[16]。在此基础上,本研究进一步探究木犀草苷对PPARα信号通路的作用机制。实验结果表明,木犀草苷与PPARα存在直接结合,并且其降脂作用被PPARα抑制剂所逆转,这表明PPARα在其木犀草苷发挥降脂活性中具有重要作用。此外,研究还发现,木犀草苷能够通过其他途径改善MAFLD,例如,激活PI3K/AKT信号通路增加肝细胞敏感性[17],修复肠道黏膜损伤及维持肠道菌群平衡[18],以及激活Sirt1/AMPK信号通路增加脂肪酸β氧化[19]等发挥改善MAFLD的作用。木犀草苷作为一种天然活性化合物,能够通过多途径改善MAFLD,其中PPARα在其降脂活性中发挥关键作用。
综上所述,本研究首次揭示了木犀草苷通过直接靶向结合PPARα,促进其核转位,进而增加下游脂肪酸氧化相关酶的基因表达,提高HFD小鼠肝脏脂肪酸氧化速率,减少肝脏脂质堆积,从而发挥改善MAFLD的作用,证明其可能是自然界存在的天然PPARα/β双激动剂,为MAFLD的临床治疗提供潜在药物开发方向。
利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献说明 邢忠刚:文章撰写及获取研究数据;贾王雅:分析实验数据;李剑、季莉莉:指导修改实验方案;徐红、孙毅:课题设计及终审终校。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。
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