孔德策， 杨怡倩， 张德华， 张帅
| 【作者机构】 | 上海市浦东新区公利医院骨科； 宁夏医科大学上海市浦东新区公利医院研究生培养基地； 上海理工大学公利医院医疗技术学院； 上海市浦东新区中医医院骨伤科 |
| 【分 类 号】 | R68 |
| 【基 金】 | 上海市浦东新区高峰高原学科建设临床医学新质专科(专病)项目(2025-PWXZ-11) 上海市浦东新区科委民生科研计划项目(PKJ2021-Y25) 上海市浦东新区卫生英才培养计划青年人才(2024PDWSYCQN-06) 上海市浦东新区卫生健康委员会优秀青年医学人才培养计划(PWRq2021-45) |
·基础研究·
绝经期妇女易患骨质疏松症,这是一种以骨量减少、骨微结构逐渐破坏及骨代谢稳态失衡为特征的全身性代谢性骨病,导致骨强度下降[1-2]。骨质疏松症具有较高的社会关注度,因其与残疾及骨折后死亡率升高相关,这主要归因于其隐匿性及早期发现率较低[3-4]。目前,骨质疏松症的诊断主要依赖于双能X射线吸收测定法,但该方法仅能提供观察结果,无法分析病理过程,这使得骨质疏松症的早期诊断变得非常困难。因此识别绝经后骨质疏松症的生物标志物对于实现早期诊断和优化疾病管理至关重要。
微小RNA(miRNA)是一类小型内源性非编码RNA分子,能够通过调控靶基因的转录和翻译过程影响骨代谢[5-6]。研究表明,miRNA在骨折风险预测方面的性能优于传统评估工具,甚至可在骨结构发生明显变化前提供早期预警。基于miRNA的检测方法具有稳定性高、非侵入性强和疾病特异性好等优势,展现出绝经后骨质疏松症早期诊断的重要应用前景[7-9]。例如,研究人员发现miR-133a在南美洲人群中作为骨质疏松症的生物标志物具有重要价值[10]。值得注意的是,miR-637对绝经后骨质疏松症具有较高的诊断特异性[11]。此外,miR-21-5p[12]和miR-23b-3p[13]可能作为绝经后女性骨质疏松症的潜在指标。研究发现,通过工程化细菌外泌体将内源性miRNA递送至骨微环境,可改善绝经后骨质疏松小鼠的骨质流失[14],这提示miRNA可能成为治疗绝经后骨质疏松症的潜在靶点。
研究发现,miR-642a-3p在从健康人群骨密度到骨质疏松症的过程中呈现持续升高的趋势[15]。这一现象的出现表明,miR-642a-3p极有可能作为绝经后女性骨质疏松症前期发展的生物标志物。通过生物信息学分析,发现EGFR可能是miR-642a-3p的潜在靶基因。KEGG生物信息学工具预测,miR-642a-3p可能参与以下信号通路:缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、叉头框蛋白O(FoxO)、Hippo及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路。然而,其在破骨细胞分化及骨质疏松症发病机制中的具体作用尚不明确。本研究探讨了miR-642a-3p在绝经后骨质疏松症发病机制中的作用。首先,在人THP-1细胞破骨细胞分化模型中首次检测了miR-642a-3p的表达谱。随后,通过慢病毒转染技术敲低THP-1细胞中的miR-642a-3p表达,并观察其对破骨细胞分化的调控作用;此外,还深入研究了miR-642a-3p调控破骨细胞分化的分子机制。
1.1.1 细胞处理 THP-1急性单核细胞白血病细胞系(SCSP-567)购买于中国科学院细胞库。培养在添加15%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中,并加入1%青霉素/链霉素和50 μmol/L β-巯基乙醇,放入条件为37 ℃、5% CO2的培养箱。为了使其向破骨细胞分化,需向悬浮的THP-1细胞中加入100 ng/mL的PMA,诱导24 h使其贴壁分化为单核巨噬细胞。为了使单核巨噬细胞进一步分化为破骨细胞,用含有50 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF的RPMI-1640完全培养基分别培养3、5和8 d。
1.1.2 主要试剂 β-巯基乙醇购自上海阿拉丁公司,规格100 mL,纯度≥99%;PMA购自北京索莱宝科技有限公司;RANKL、M-CSF购自美国PEPROTECH公司;小牛骨切片购自上海千曦生物有限公司;BIOG miRNA茎环法反转录试剂盒、BIOG miRNA茎环染料法荧光定量PCR试剂盒购自常州百代生物科技股份有限公司;反转录试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自日本东洋纺公司;anti-MMP9购自美国Cell Signaling Technology公司;anti-NFATc1、anti-β-actin购自武汉Proteintech公司;anti-HIF-1α、anti-EGFR购自上海Beyotime公司;anti-CTSK购自美国Abcam公司。引物订购于北京六合华大基因科技有限公司,序列见表1。
表1 引物序列
Tab.1 Primer sequence
基因名称正向序列反向序列hsa-NFATc1GCAGAGCACGGACAG-CTATCGGGCTTTCTCCACGAA-AATGAhsa-ACP5GACTGTGCAGATCCT-GGGTGGGTCAGAGAATACGTC-CTCAAAGhsa-CTSKACACCCACTGGGAGC-TATGGACAGGGGTACTTTGA-GTCCAhsa-EGFRAGACAGCTTCTTGCA-GCGATTTCCAGACAAGCCACT-CACChsa-HIF-1αCGGCGCGAACGACAA-GAAAAAGAATGTGGAAGTGGCAAC-TGATGAGCAhsa-GAPDHGGTCACCAGGGCTGC-TTTTAGGATCTCGCTCCTGGA-AGATG
1.2.1 Thp-1细胞诱导分化为破骨细胞 向悬浮的THP-1细胞中加入终浓度为100 ng/mL的PMA,诱导24 h使其贴壁分化为单核巨噬细胞。为了使单核巨噬细胞进一步分化为破骨细胞,用含有50 ng/mL RANKL和30 ng/mL M-CSF RPMI-1640完全培养基分别培养3、5和8 d。
1.2.2 骨吸收陷窝试验 使用直径6 mm、厚度150 μm的小牛骨切片,对其进行预处理后放入96孔板中,将悬浮的THP-1细胞(1×104个)覆盖在预处理好的骨切片表面,在100 ng/mL的PMA中处理24 h,贴壁后加入RANKL和M-CSF诱导单核巨噬细胞分化3、5和8 d。诱导分化完成后,戊二醛固定液固定,再放入0.25 mol/L的氨水中去除骨片表面的细胞,并用超声波清洗仪清洗,使用不同浓度乙醇进行梯度脱水,1%甲苯胺蓝溶液染色后超声清洗3次,使用奥林巴斯显微镜镜下观察骨吸收陷窝区域,并使用ImageJ软件定量分析陷窝数量。
1.2.3 TRAP染色 使用14 mm的细胞爬片,将细胞接种并诱导完成后,加入4%多聚甲醛,室温固定30 min,PBS洗涤3次后加入抗酒石酸酸性磷酸酶染色液进行染色,并使用奥林巴斯显微镜镜下观察。
1.2.4 反转录-定量聚合酶链反应(qRT-PCR) 总RNA的获取根据试剂商的说明,使用飞捷fast 2000 RNA提取试剂盒获取分化第3、5、8天的破骨细胞总RNA。本实验使用BIOG miRNA茎环法反转录试剂盒,按照说明书对miRNA进行反转录。使用TIYOBO反转录试剂盒对mRNA进行反转录,然后根据BIOG miRNA茎环染料法荧光定量PCR试剂盒和TOYOBO SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒要求,分别设计miRNA和mRNA实时PCR反应体系,置入Applied Biosystems实时定量荧光PCR仪中进行qRT-PCR检测。每个样本重复3次,采用2-ΔΔCt计算方法,以U6 small nuclear RNA(U6 snRNA)和GAPDH为对照,分别对miRNA和mRNA进行归一化处理。
1.2.5 Western印迹法 使用含有1%蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA缓冲液从各组细胞中提取总蛋白,以12 000×g离心15 min后,收集上清液。根据说明使用快速蛋白质定量试剂盒(BCA法)对蛋白浓度进行定量测定。使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,并将其转移到PVDF膜上。在室温下用5%脱脂奶粉封闭膜2 h,然后与一抗在4 ℃下孵育过夜。然后用山羊抗兔IgG二抗和抗小鼠IgG二抗在室温孵育1 h。然后,使用SuperKine超敏型ECL发光液将目标条带可视化。
1.2.6 靶基因预测 为了探讨miR-642a-3p影响破骨细胞分化的机制,使用了3个独立的数据库来预测miR-642a-3p的靶基因:TargetScan8.0(http:∥www.targetscan.org/)、miRDB(http:∥www.mirdb.org/)和DisGeNET(http:∥disgenet.com)。随后,通过KEGG富集分析对靶向分子进行筛选以识别重要通路,并利用骨质疏松症数据集GSE35958识别关键上游调控靶点。
数据采用GraphPad Prism 9.5软件进行统计分析。结果以均值±标准差
表示。两组间比较采用t检验。多组间采用单因素或双因素方差分析进行评估。P<0.05为差异有统计学意义。
骨吸收陷窝结果显示,加入RANKL(50 ng/mL)和M-CSF(30 ng/mL)的THP-1细胞中,陷窝的数量和面积在3、5和8 d内逐渐增加。与诱导第5天[(1.25±0.11) mm2]相比,第8天破骨细胞形成的陷窝面积显著增加至(2.77±0.25) mm2,增加约2.2倍(P<0.01)。同时TRAP染色显示第8天的破骨细胞较大,数量多且胞质颜色深。这表明THP-1细胞在第8天有效分化为具有骨吸收能力的破骨细胞。
qRT-PCR检测结果显示破骨细胞分化相关基因NFATc1、CTSK和ACP5的mRNA表达水平随诱导时间延长逐渐升高,并于第8天达到峰值(P<0.001)。Western印迹法分析进一步证实,破骨细胞特异性蛋白MMP9、NFATc1和CTSK的表达量亦呈时间依赖性上调趋势。见图1。
图1 破骨细胞成功分化
Fig.1 Successful differentiation of osteoclasts
A:第3、5、8天进行骨吸收陷窝试验;B:骨吸收区域的定量分析;C:第3、5、8天进行TRAP染色试验;D:破骨细胞基因NFATc1、CTSK、ACP5的mRNA表达;E:Western印迹法检测破骨细胞相关蛋白的条带;F:破骨细胞相关蛋白水平变化的灰度值分析;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns表示差异无统计学意义。
qRT-PCR检测显示,miR-642a-3p的表达水平与破骨细胞分化进程呈正相关性,并于第8天达到峰值(4.52±0.79)(P<0.05)。慢病毒载体转染THP-1细胞中构建miR-642a-3p敲低模型,荧光显微镜下观察显示绿色荧光表达阳性,证明转染成功。qRT-PCR验证显示,转染组的miR-642a-3p表达量较阴性对照组显著降低60%(P<0.001)。见图2。
图2 在破骨细胞分化过程中,miR-642a-3p的表达水平升高
Fig.2 The expression of miR-642a-3p increases during the differentiation of osteoclasts
A:qRT-PCR检测破骨细胞分化过程中miR-642a-3p的表达趋势;B:荧光显微镜观察慢病毒转染后的THP-1细胞转染情况;C:qRT-PCR检测Sh-miR-642a-3p组和NC组的miR-642a-3p表达量;*P<0.05,***P<0.001。
骨吸收陷窝实验与TRAP染色实验均显示,与NC组相比,Sh-miR-642a-3p组的破骨细胞数量明显减少(P<0.01)。qRT-PCR进一步证实,与NC组相比(1.00±0.11),Sh-miR-642a-3p组的NFATc1表达量显著降低至(0.45±0.07)(P<0.001),CTSK的表达量降低了54.7%(P<0.001),ACP5的表达量降低了84.0%(P<0.001)。Western印迹法结果显示,MMP9蛋白表达量从(1.00±0.12)降至(0.56±0.17)(P<0.05),NFATc1蛋白表达量从降至(1.00±0.16)降至(0.20±0.08)(P<0.01)和CTSK蛋白表达量1.00±0.03降至0.57±0.12(P<0.01)。这些结果表明,miR-642a-3p具有促进破骨细胞分化的作用。见图3。
图3 miR-642a-3p促进破骨细胞分化
Fig.3 miR-642a-3p promotes osteoclast differentiation
A:NC组和Sh-miR-642a-3p的骨吸收陷窝实验;B:NC组和Sh-miR-642a-3p骨吸收陷窝数量;C:NC组和Sh-miR-642a-3p的TRAP染色实验;D:NC组和Sh-miR-642a-3p的破骨细胞基因NFATc1、CTSK、ACP5的mRNA表达;E:Western印迹法检测破骨细胞相关蛋白的条带;F:破骨细胞相关蛋白水平变化的灰度值分析;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000 1。
通过TargetScan、miRDB和DisGeNET数据库的韦恩图交叉分析,共筛选出34个miR-642a-3p的潜在靶基因(图4A)。KEGG通路富集分析显示,这些靶基因显著富集于5条信号通路(P<0.05),其中HIF-1α信号通路富集程度最高(图4B)。基于通路-基因和弦图分析,发现IFNG、TFRC、ANGPT1、MAPK3、SERPINE1和EGFR等基因在HIF-1α通路中显著富集(图4C)。为验证上述基因在骨质疏松症中的表达模式,利用GEO数据集GSE35958进行差异分析(筛选标准:|log2FC|>2.5,P<0.05),共获得1 473个骨质疏松相关差异表达基因(图4D、E)。进一步聚焦HIF-1α通路中的6个候选基因,箱线图分析显示:与对照组相比,骨质疏松组中EGFR表达显著上调(P<0.05)(图4F)。综上,生物信息学预测提示:miR-642a-3p可能通过调控HIF-1α信号通路(特别是其关键组分EGFR)参与破骨细胞分化过程。
图4 采用生物信息学方法预测miR-642a-3p的下游靶基因及信号转导通路
Fig.4 Using bioinformatics to forecast the downstream targets and signaling pathways of miR-642a-3p
A:3个数据库中预测靶基因的韦恩图;B:KEGG富集分析用于预测通路;C:和弦图;D:GSE35958数据集的基因表达谱火山图;E:GSE35958数据集表达谱热图;F:正常对照组与骨质疏松组中EGFR基因表达水平的箱线图比较;*P<0.05。
随着破骨细胞的成熟与分化,EGFR和HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)(图5A～D)。为进一步探究miR-642a-3p的作用,利用慢病毒转染来敲低THP-1细胞中的miR-642a-3p,并在8 d诱导期后检测NC组和Sh-miR-642a-3p组的mRNA及蛋白表达水平。结果显示,敲低组(Sh-miR-642a-3p)中HIF-1α和EGFR的表达同步下调(P<0.05)(图5E～G)。该结果与生物信息学分析一致,提示miR-642a-3p可能通过维持HIF-1α/EGFR通路活性促进破骨细胞分化。
图5 miR-642a-3p通过HIF-1α/EGFR/信号通路促进破骨细胞分化
Fig.5 miR-642a-3p promotes osteoclast differentiation through EGFR/HIF-1α signaling pathway
A:破骨细胞诱导3、5、8 d后EGFR和HIF-1α mRNA的表达水平;B:Western印迹法检测EGFR和HIF-1α蛋白的条带;C:EGFR蛋白水平变化的灰度值分析;D:HIF-1α蛋白水平变化的灰度值分析;E:NC组和Sh-miR-642a-3p的EGFR和HIF-1α mRNA的表达水平;F:Western印迹法检测EGFR和HIF-1α蛋白的条带;G:EGFR和HIF-1α蛋白水平变化的灰度值分析;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns表示差异无统计学意义。
绝经后骨质疏松症作为一种慢性代谢性疾病,目前仍缺乏有效的预防和治疗措施。一项流行病学研究显示,全球骨质疏松症的患病率为19.7%,且中国每年约有68.7万人因骨质疏松性骨折而遭受痛苦[16]。随着疾病的发生和发展,骨微结构受到损伤,骨的机械强度显著降低,这使得患者容易发生反复骨折和骨折不愈合[17-18]。传统诊断方法通常仅在患者出现骨痛和骨折等临床症状后才被采用[19]。因此,对于绝经后女性而言,探索骨质疏松可能的潜在发病机制以尽早干预骨质疏松症显得至关重要。研究发现,在绝经后骨质流失过程中,miR-642a-3p呈现序贯性增加趋势[15],这表明miR-642a-3p可能在绝经后妇女的骨质疏松症中发挥一定作用。本研究进一步证实了miR-642a-3p的表达在破骨细胞分化过程中增加,且其敲低会影响THP-1细胞向破骨细胞分化的过程以及破骨细胞的数量。这些研究结果表明,miR-642a-3p可通过促进破骨细胞分化来参与骨质疏松症的发病机制。
值得注意的是,尽管大量研究探讨miRNA与骨质疏松症的关联,但其作为早期诊断标志物的应用仍有限。现有研究多基于血液样本分析特定miRNA(如miR-21[20]、miR-9-5p[21]、miR-29[22]、miR-122-5p[23])的调控作用,但缺乏对疾病进程中miRNA动态变化的系统分析。miR-642a-3p是目前唯一被证实在非骨质疏松对照组、骨量减少及骨质疏松患者中均持续升高的miRNA,深入阐明其下游作用靶点及分子机制,对于早期干预可能发生的骨质疏松症具有重要价值。为解析miR-642a-3p的作用机制,本研究结合生物信息学预测和实验验证,识别出EGFR是其关键的潜在调控靶点。EGFR是跨膜生长因子受体蛋白家族的一员,在骨骼生物学和病理学中发挥着关键作用。一些研究人员报告称,EGFR的激活对成骨细胞分化至关重要。例如,Dong等[24]的研究表明,EGFR促进成骨细胞系的增殖并抑制破骨细胞的分化。此外,Liu等[25]发现,EGFR信号转导的下调可导致成骨前体细胞的衰老以及皮质骨内膜表面骨形成能力的下降。此外,EGFR在骨质疏松症的治疗中也发挥着重要作用。例如,Chen等[26]的研究阐明EGFR可作为靶点抑制BMSC铁死亡,并可能延缓骨质疏松症发展。此外,Cao等[27]证实EGFR是二甲双胍在成骨前体细胞中的作用靶点,其通过EGFR/GSK-3β/钙信号轴调控氧化应激反应,在二甲双胍逆转绝经后骨质疏松症中发挥关键作用。然而,关于EGFR在破骨细胞生成中的作用,现有研究结果仍存在争议。Taverna等[28]的研究表明,非小细胞肺癌细胞来源的外泌体可诱导前破骨细胞中EGFR通路的激活,进而导致RANKL表达增加并促进破骨细胞的分化;Jia等[29]也提出EGFR是调控巨噬细胞/破骨细胞介导的骨吸收相关疾病的潜在治疗靶点。
值得注意的是,本研究观察到在破骨细胞分化的第3、5、8天,EGFR的表达水平呈现与miR-642a-3p一致的逐步上升趋势。这一现象与经典miRNA负向调控靶基因的理论预期(即miRNA升高应导致靶基因表达降低)相悖。经典理论认为,miRNA主要通过结合靶基因mRNA的3′非翻译区3(′UTR)诱导其降解或翻译抑制[30-31]。因此推测,miR-642a-3p对EGFR的调控可能涉及非经典机制,例如:作为增强子RNA(eRNA)或通过与启动子区域相互作用介导转录激活[32],或通过结合特定UTR元件在特定条件下(如缺氧、分化信号刺激下)反而促进EGFR mRNA的稳定或翻译效率[33-34]。这种正向调控模式在部分miRNA中已有报道,但具体机制有待深入验证。本研究结果提示,在破骨细胞分化背景下,miR-642a-3p可能通过上述非经典途径正向调节EGFR表达,从而发挥促破骨细胞分化作用。
为阐明miR-642a-3p-EGFR轴在骨质疏松症中的下游通路,本研究通过KEGG富集分析锁定HIF-1α信号通路为最显著通路。进一步结合骨质疏松数据集GSE35958分析发现,EGFR在该通路中显著富集且在骨质疏松样本中表达显著上调(P<0.05)。实验验证显示,在破骨细胞分化过程中,EGFR及HIF-1α的mRNA和蛋白表达均同步上调;而敲低miR-642a-3p、EGFR及HIF-1α的表达同步下调(P<0.01)。HIF-1α信号通路在骨代谢稳态及骨质疏松等骨病中具有关键作用[35]。已有研究证实,在病理性骨吸收相关的缺氧微环境中,HIF-1α是调控骨稳态的核心因子,其可通过激活MAPK等通路增强RANKL诱导的破骨细胞分化[36]。本研究结果表明,在THP-1破骨分化模型中,EGFR/HIF-1α信号通路被显著激活,且其激活状态受miR-642a-3p正向调控。因此,本研究揭示了一条新的调控轴:miR-642a-3p可能通过非经典方式激活EGFR-HIF-1α通路促进破骨细胞分化。
尽管本研究通过生物信息学筛选和功能验证,识别了miR-642a-3p/EGFR/HIF-1α轴在破骨细胞分化中的重要性。然而,本研究并未利用动物模型探讨miR-642a-3p在体内的潜在影响,也未明确后续实验的方向,这是本研究的局限性。此外,还需要进行更多研究以充分阐明miR-642a-3p在骨质疏松症进展过程中与EGFR/HIF-1α通路相互作用的详细机制。进一步的研究需要评估其在骨质疏松症患者临床试验中的应用潜力。
综上所述,研究提出了一种新的机制,即miR-642a-3p通过激活HIF-1α/EGFR通路促进破骨细胞分化。这些结果为绝经后骨质疏松症的早期诊断和治疗提供了新见解,表明miR-642a-3p可能成为绝经后骨质疏松症的潜在治疗靶点。
利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献说明 孔德策:实验设计、分析数据及论文撰写;杨怡倩:图表制作及数据分析;张德华:细胞实验、生物信息学及统计分析;张帅:实验指导、论文修改。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。
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