DOI:10.12289/j.issn.2097-4345.25161
中图分类号:R725.5
耿锐， 秦雪艳， 乔晓红， 卢双龙
| 【作者机构】 | 同济大学附属同济医院儿科 |
| 【分 类 号】 | R725.5 |
| 【基 金】 | 上海市普陀区儿科医疗联合体建设项目(PTELT-2024-10) |
·基础研究·
急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种儿童高发的血液恶性肿瘤,其发生发展受遗传突变、环境暴露以及肠道菌群等多种因素影响。近期研究提示肠道菌群可能通过影响淋巴细胞增殖和免疫应答来参与儿童ALL发病发展进程[1-4]。ALL患者常伴有肠道菌群失调,表现为多样性、组成和功能改变。确诊时,患儿肠道微生物群成熟延迟,肠道中产生短链脂肪酸菌属丰度显著降低,菌群失调会促进免疫反应失调,最终增加前白血病克隆在常见感染触发下的转化风险[1]。
化疗是ALL患儿的主要治疗手段,化疗会改变菌群组成,如拟杆菌门减少,梭菌科和链球菌科增加[5-7],潜在致病菌的定植水平相对增加,细菌多样性在化疗后呈现下降趋势[8-10]。肠道菌群的改变可能导致胃肠道副作用,引起腹泻、恶心和呕吐,进而进一步加重菌群紊乱。已经有报道指出,肠道菌群的组成特征可用于评估ALL初诊患者的感染风险[9]。
以往研究多关注ALL患者肠道菌群组成和多样性变化,微生物群功能改变及其具体影响的研究相对少见。本研究聚焦于前体B型ALL,利用公开数据库分析ALL患儿在诊断时(化疗前)肠道微生物酶丰度的改变特征;结合ETV6-RUNX1阳性ALL患者细胞的基因表达谱,寻找前体B型ALL患儿肠道菌群可能的代谢网络;并进一步采用长双歧杆菌与前体B型ALL细胞系NALM6共培养模型,探讨菌群对ALL细胞中一种关键代谢酶ALDH7A1的表达。探索ALL患儿肠道菌群酶的丰度变化与宿主基因表达变化间的关联性及菌群对肿瘤细胞酶生成的影响。
16S rRNA FASTQ格式原始序列收集自Rajagopala等[11]的研究,采用QIIME 2(2020.2)[12]平台分析,由dada2 denoise-paired模块去除低质量序列并生成扩增子序列变异特征序列。利用基于Silva数据库(版本138)的非冗余分类器对生成的特征序列进行物种分类注释,相似性阈值设定为97%。微生物群落的酶丰度谱则通过PICRUSt2[13]软件进行预测。
首先,利用FastQC v0.12.1对源自Koldobskiy等[14]的测序数据进行质量评估。随后,采用Trimmomatic v0.39[15]去除测序接头及低质量序列,具体参数设置为:ILLUMINACLIP∶TruSeq3-PE.fa∶2∶30∶10 LEADING∶3 TRAILING∶3 SLIDINGWINDOW∶4∶15 MINLEN∶36。处理后的高质量序列通过STAR v2.7.11a软件比对至人类参考基因组GRCh38[16]。基因表达计数则利用Subread软件包中的featureCounts v2.0.6[17]程序进行汇总提取。
1.3.1 NALM6细胞培养 人前体B细胞型ALL细胞系NALM6购自美国ATCC生物标准品资源中心。该细胞系培养于含10%胎牛血清(ExCell Bio公司)及1%青霉素-链霉素溶液(Gibco公司)的RPMI 1640培养基(Gibco公司)中。培养条件为37 ℃、5% CO2。
1.3.2 细菌菌株与培养条件 长双歧杆菌菌株E194b(Bifidobacterium longum E194b,ATCC 15707,以下简称B. longum)购自美国ATCC生物标准品资源中心。该菌株在补充有5%(v/v)脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆培养基(BD Biosciences公司)上,于37 ℃厌氧条件下培养48 h。
1.3.3 B. longum感染实验 采用孔径为0.4 μm的Transwell小室(Corning Life Sciences公司)置于6孔培养板中进行。将数量为5×105的NALM6细胞接种于Transwell上室,并加入1 mL新鲜完全培养基。下室则加入1 mL重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的B. longum菌悬液。NALM6细胞与B. longum以100∶1的感染复数(multiplicity of infection,MOI)进行共培养;对照组细胞则仅用PBS进行处理。共培养4 h后,更换上下室培养基为新鲜完全培养基各1 mL。继续培养20 h后,参照先前报道的方法[18]收集细胞用于后续的Western印迹法分析。
1.3.4 Western印迹法分析 检测使用抗体:兔源抗ALDH7A1单克隆抗体(货号ab53278; Abcam,UK)和小鼠源抗GAPDH单克隆抗体(货号60004-1-Ig,Proteintech公司),HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体(货号SA00001-1,Proteintech公司)和HRP标记的羊抗兔IgG抗体(货号SA00001-2,Proteintech公司)。蛋白条带的信号强度通过ImageJ软件进行定量分析。
ALL组与健康对照组间微生物酶功能丰度差异、蛋白条带信号强度的组间差异的统计学检验采用Welch’s t检验,该分析通过R语言环境下的t.test函数实现。编码EC 1.2.1.3酶的微生物进化树分析则使用AnnoTree[19]进行构建。双歧杆菌属(Bifidobacterium)与EC 1.2.1.3酶丰度之间的Pearson相关性分析,通过R语言的cor.test函数进行检验。P<0.05为差异有统计学意义。
为探究前体B型ALL患儿肠道微生物酶的表达及活性,本研究分析了源自Rajagopala等[11]的公开宏基因组数据。分析结果显示,相较于健康对照组,前体B型ALL患儿的肠道微生物酶的表达呈现显著差异(图1A)。
图1 ALL患者肠道菌群功能变化
Fig.1 Gut microbiota functional changes in ALL children
A:ALL患者中改变的微生物酶;B:EC 3.5.4.4在ALL中显著降低(Welch’s t=2.601,P=0.014 6);C:EC 3.5.3.18在ALL中显著降低(Welch’s t=2.704,P=0.011 9);D:EC 1.2.1.3在ALL中显著降低(Welch’s t=3.086,P=0.003 8)。
其中在ALL患儿肠道中表达显著升高的微生物功能酶包括透明质酸裂解酶(EC 4.2.2.1,hyaluronate lyase,Welch’s t=2.535,P=0.021)、植物烯合成酶(EC 2.5.1.32,phytoene synthetase,Welch’s t=2.445,P=0.023 8)、甲基硫代核糖激酶(EC 2.7.1.100,methylthioribose kinase,Welch’s t=2.270,P=0.032 2)等,显著降低的酶有UDP-N-乙酰半乳糖胺二磷酸化酶(EC 2.7.7.83,UDP-N-acetylgalactosamine diphosphorylase,Welch’s t=-3.030,P=0.006 2)、内肽酶I(EC 3.4.19.11,endopeptidase I,Welch’s t=-3.032,P=0.005 7)、CTP:N,N′-二乙酰军团菌氨酸胞苷酰转移酶(EC 2.7.7.82,CMP-N,N′-diacetyllegionaminic acid synthase,Welch’s t=-3.499,P=0.002 0)等。
许多发生改变的微生物功能具有相应的人类同工酶。人类ADA基因编码的腺苷脱氨酶(EC 3.5.4.4,adenosine deaminase),催化腺苷向肌苷的转化。与人类ADA基因同工的ALL患儿肠道微生物来源的腺苷脱氨酶(EC 3.5.4.4)活性呈现降低趋势(Welch’s t=2.601,P=0.014 6)(图1B)。微生物来源的二甲基精氨酸酶(EC 3.5.3.18,dimethylargininase)在ALL患儿的肠道微生物中,该酶的活性呈降低趋势(Welch’s t=2.704,P=0.011 9)(图1C)。人类ALDH家族中ALDH7A1基因编码的醛脱氢酶(EC 1.2.1.3,aldehyde dehydrogenase)其微生物来源的同工酶在ALL患儿的,显著降低(Welch’s t=3.086,P=0.003 8)(图1D)。
为探究ALL患儿肠道微生物酶和代谢功能间的潜在关联,本研究筛选了丰度差异倍数(fold change)绝对值大于0.4的微生物酶,基于KEGG数据库提供的生化反应信息,构建了一个以共享代谢物为连接节点的肠道菌群功能网络(图2)。该网络分析显示,在ALL患儿的肠道菌群中,短链脂肪酸代谢(图2A)及葡萄糖代谢(图2B)通路呈现显著改变。
图2 失调的肠道菌群功能代谢网络
Fig.2 Dysfunctional metabolic network of the gut microbiota
A:与EC 4.4.1.1、EC 4.1.2.52、EC 1.1.1.38相关的代谢网络;B:与EC 2.7.7.12、EC 2.4.1.247、EC 2.4.1.230和EC 5.4.99.16相关的代谢网络;C:与EC 1.2.1.3相关的代谢网络;代谢网络中节点表示代谢物,边为微生物酶;红色边表明该酶丰度在ALL患者中升高,绿色表示降低。
在ALL患儿的肠道菌群中,观察到3种与丙酮酸代谢(消耗或产生)相关的微生物酶丰度发生改变,包括高丝氨酸脱氨酶升高(EC 4.4.1.1,homoserine deaminase,Welch’s t=2.478,P=0.019 3)、HHED醛缩酶升高(EC 4.1.2.52,HHED aldolase,Welch’s t=2.101,P=0.042 8)和丙酮酸-苹果酸羧化酶降低(EC 1.1.1.38,pyruvic-malic carboxylase,Welch’s t=-3.377,P=0.002 1),提示ALL患儿丙酮酸代谢存在异常(图2A)。
代谢网络分析同时提示ALL患儿葡萄糖代谢(图2B)通路呈现显著改变。
其中葡萄糖直接代谢酶在ALL患儿的微生物酶中,海藻糖磷酸化酶升高(EC 2.4.1.230,kojibiose phosphorylase,Welch’s t=2.525,P=0.018 9),蔗糖磷酸化酶降低(EC 2.4.1.7,sucrose phosphorylase,Welch’s t=-3.723,P=0.000 9)。
醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)介导的吲哚乙酸(indol-3-yl Acetate)与吲哚乙醛(Indole-3-acetaldehyde)等代谢物的转换网络同时也发生变化(图2C)。
本研究分析了来自转录组数据[14]ETV6-RUNX1阳性细胞和正常CD19+细胞的基因表达谱。除先前提及的ADA和DDAH外,本研究还鉴定了多个与肠道菌群功能相对应的宿主同工酶基因,这些基因同样表现出同步性改变(图3)。
图3 ETV6-RUNX1阳性细胞基因表达变化
Fig.3 Gene expression in ETV6-RUNX1 of ALL children
A:人类同工酶在ETV6-RUNX1阳性细胞中的表达热图,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;B:微生物来源的EC 1.1.1.38在ALL中显著降低(Welch’s t=3.155,P=0.003 5);C:微生物来源的EC 1.3.8.1在ALL中显著降低(Welch’s t=3.540,P=0.001 3);D:微生物来源的EC 2.7.1.83在ALL中显著降低(Welch’s t=2.992,P=0.006 0);E:微生物来源的EC 2.7.9.3在ALL中显著降低(Welch’s t=2.807,P=0.008 8);HC:健康对照组。
基因表达谱分析表明,ETV6-RUNX1阳性细胞中多个参与核心代谢通路的酶编码基因呈现同步上调趋势,包括ALDH和DDAH家族基因,以及ACADS和GPC2等关键分子。(图3A)。尽管上述基因在宿主细胞中的表达水平升高,但相应的微生物来源功能却呈现降低趋势(图3C～E)。以ALDH家族中ALDH7A1为例,其在ETV6-RUNX1阳性细胞中表达显著上调,与其共同功能的微生物来源的EC:1.2.1.3在ALL患儿中显著下调(图1D)。此外,还观察到微生物来源的功能EC 1.1.1.38(Welch’s t=2.807,P=0.008 8)(图3B)及其人类同工酶ME2(Welch’s t=-2.203 9,P=0.042 8)在ALL患儿中均呈现下降趋势。
基于公共队列分析揭示ALL中宿主与微生物功能相似的酶在宿主-微生物代谢互作中具有重要作用,本研究聚焦醛脱氢酶(EC 1.2.1.3)这一关键代谢酶,其通过催化醛类物质氧化为羧酸参与宿主-微生物代谢互作。人类ALDH家族成员(如ALDH7A1和ALDH1A1)执行此催化过程,其在ALL患者中呈现显著上调特征,尤其ALDH7A1(图3A),ALL患儿肠道菌群来源的醛脱氢酶功能呈现下调趋势(图3C),人源与微生物源的两种同工酶在ALL患儿中表现出相反的趋势,这可能是由于其共同竞争底物引起的。
通过AnnoTree[19]系统发育分析显示,编码EC 1.2.1.3酶的微生物物种主要分布于变形菌门(Proteobacteria,37.2%)、放线菌门(Actinobacteriota,18.5%)及拟杆菌门(Bacteroidota,12.8%)(图4A、B)。值得注意的是,在ALL患者队列中,双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度与微生物来源的EC 1.2.1.3酶丰度呈显著正相关(r=0.531,P=0.004 3),提示该菌属可能是维持肠道醛脱氢酶功能的关键菌群成员(图4C)。
图4 双歧杆菌改变NALM6细胞ALDH7A1的表达
Fig.4 Bifidobacterium has the potential to alter ALDH7A1 expression in ALL children
A:能够编码酶EC 1.2.1.3的微生物的系统发育树(红色高亮显示);B:编码酶EC 1.2.1.3的微生物物种的门级分类;C:双歧杆菌属的丰度与肠道菌群中酶EC 1.2.1.3的丰度呈正相关;D、E:通过Western印迹法检测和定量分析得到的ALDH7A1表达量(Welch’s t=2.989,P=0.040 7)。
为进一步验证菌群对宿主代谢酶的调控作用,本研究采用多孔膜分隔的共培养装置,将长双歧杆菌(B. longum)与ALL细胞系NALM6共培养。Western印迹法结果显示,与对照组相比,共培养组NALM6细胞的ALDH7A1蛋白表达量显著降低(Welch’s t=2.989,P=0.040 7)(图4D、E)。
ALL是儿童期最常见的恶性肿瘤,在15岁以下儿童恶性肿瘤病例中占比高达25%,其中前体B型是ALL最主要的亚型[20]。根据《国家儿童肿瘤监测年报2022》,我国男孩白血病发病率4.185/10万,女孩白血病发病率3.365/10万,是我国儿童肿瘤中发病率最高的。
儿童ALL的治疗已取得了显著的成果,在化疗方案优化及CAR-T等治疗推动下,高危患儿生存率显著提升,5年总生存率达到93.5%[20]。值得注意的是,大剂量化疗对肠道菌群稳态的破坏已成为影响预后的关键因素——诱导化疗期间α多样性指数呈现持续降低的趋势,长双歧杆菌等微生物丰度出现显著改变,这种生态失衡与患者的感染事件直接相关[21]。有研究显示肠道菌群的多样性和丰度或特定分类群可以作为接受治疗的ALL患者感染、复发和死亡的可靠独立预测因子[3,22]。有观点认为,肠道菌群产生的短链脂肪酸的改变,影响了肠道上皮屏障的完整性,导致免疫反应失调,叠加ALL患者肿瘤细胞基因突变,这种双重打击模型是ALL不良预后的重要原因[1]。
本研究首先分析了ALL患儿肠道微生物酶改变的情况。在显著变化的酶中,透明质酸裂解酶的丰度增幅最为显著,该酶催化透明质酸链降解为N-3-(4-脱氧-β-D-葡糖-4-烯糖醛酸基)-N-乙酰-D-氨基葡萄糖。此结果提示透明质酸代谢可能在前体B型ALL的病理生理过程中扮演潜在角色。既往研究已证实,透明质酸参与循环造血干细胞向骨髓的归巢过程,而骨髓是ALL发生、发展的关键部位[23]。ALL患者血清透明质酸浓度升高,且该指标与不良预后相关[24]。在丰度显著降低的微生物功能中,内肽酶I EC 3.4.19.11已被报道与结直肠癌预后相关[25],并在多种恶性肿瘤中呈现表达失调[26-27]。同样在ALL患儿肠道菌群中丰度降低的UDP-N-乙酰半乳糖胺二磷酸化酶EC 2.7.7.83是UDP-N-乙酰-D-半乳糖胺(UDP-GalNAc)生物合成途径中的关键酶。UDP-GalNAc作为蛋白质O-糖基化的必需糖供体,已被证明能够影响癌细胞对化疗的敏感性[28]。
许多发生改变的微生物功能具有相应的人类同工酶。微生物来源的腺苷脱氨酶(EC 3.5.4.4),在ALL患儿中显著降低,相应的,人类编码腺苷脱氨酶的ADA家族蛋白已被确立为ALL患者诊断及病情监测的生物标志物。据报道,相较于缓解期患者或健康对照组,初诊及复发ALL患者的ADA活性显著升高[29]。本研究显示在ALL患儿的肠道微生物中二甲基精氨酸酶(EC 3.5.3.18)的活性呈降低趋势。该酶催化二甲基精氨酸(ADMA)生成L-精氨酸。ADMA作为内源性一氧化氮合成抑制剂,其水平升高与内皮功能障碍相关。Doroszko等[30]的研究显示,ADMA可诱发内皮功能障碍,且ALL患儿血浆ADMA水平呈升高状态。这些结果提示,ALL患儿肠道微生物酶的显著改变可能深刻影响宿主的生理状态,并可能参与该疾病的发病机制。
本研究结果显示,ALL患儿有3种与丙酮酸代谢相关的微生物酶丰度发生改变。丙酮酸作为糖酵解途径的关键产物,其生成反映了细胞通过分解葡萄糖获取能量的过程。癌细胞为满足其增殖所需的能量,常表现出增强的糖酵解速率,导致丙酮酸累积[31]。与上述能量代谢变化相符,ALL患儿葡萄糖代谢亦呈现失调状态。D-葡萄糖-1-磷酸与D-半乳糖-1-磷酸是半乳糖代谢通路中的关键中间产物,参与其合成或降解过程的酶活性改变可能影响与ALL疾病进展相关的细胞生物学过程。已有研究证实,多种类型的恶性肿瘤普遍存在葡萄糖及果糖代谢的整体性紊乱[32]。
ETV6-RUNX1融合基因是前体B型ALL最常见的基因变异类型。为了探究ALL患儿对肠道微生物酶改变的响应,本研究分析了ETV6-RUNX1阳性细胞表达谱改变情况,本研究观察到许多宿主和微生物酶在ALL患者中表现出协同变化,包括ACADS、GPC2等。其中ACADS编码的丁酰辅酶A脱氢酶(butyryl-CoA dehydrogenase),其作用底物包括丁酸和乙酰乙酸等短链脂肪酸,该基因已被证实作为肝细胞癌[33-34]及结直肠癌[35]等多种恶性肿瘤的生物标志物。免疫组化研究证实,GPC2蛋白在多数恶性肿瘤中呈现显著高表达特征[36],而SEPHS1则被发现具有促进肿瘤细胞侵袭的生物学功能[37]。微生物来源与宿主来源的腺苷脱氨酶、二甲基精氨酸酶、高丝氨酸脱氨酶、HHED醛缩酶、丙酮酸-苹果酸羧化酶在ALL患者中均表现出丰度的降低或升高,这些协同变化可能为解读肠道菌群与宿主之间的相互作用提供另一种视角,即“菌群-宿主代谢轴”。ALL患者自身能量代谢、氨基酸代谢均出现异常[38-39],靶向微生物源同工酶或调控菌群组成,从而改善宿主代谢异常状况,或可改善ALL治疗反应和预后。
醛脱氢酶(EC 1.2.1.3,ALDHs)是一类催化醛氧化为羧酸的酶。人类ALDH超家族包含19种不同的同工酶,具有独特的组织表达特征与底物特异性。多项研究证实,ALDH可作为重要标志物用于识别和定量人类造血干细胞及癌症干细胞,尤其是白血病干细胞。ALDH7A1定位于5q31,在人与小鼠造血干细胞均表达[40]。近有研究对七种B-ALL开展了全基因组CRISPR基因敲除筛选,通过多种细胞与分子生物学手段,证实铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)在B-ALL细胞中表达显著低下,B-ALL对铁死亡诱导具有高度易损性,外源性表达FSP1可挽救这种易损性[41]。另Cell杂志2025年4月最新研究显示ALDH7A1可生成细胞膜上的NADH以支持FSP1活性,同时促进FSP1向细胞膜募集,抵御铁死亡[42]。ALDH7A1作为醛脱氢酶家族成员,主要催化α-氨基己二酸半醛(α-AASA)氧化为α-氨基己二酸,是赖氨酸分解代谢的关键酶。该酶除与白血病相关外,还与口腔癌[43]、前列腺癌[44]等多种癌症相关。
本研究观察到ALL患儿ALDH7A1以及其肠道微生物来源的同工酶EC 1.2.1.3相较健康人群均发生了改变。从代谢产物上来看,EC 1.2.1.3介导吲哚乙酸、5-羟基吲哚等吲哚衍生物的转化,已经有多项研究报道了肠道菌群产生的吲哚衍生物可以增强癌症化疗效果[45],增强CD8+T细胞功能,促进患者对免疫治疗的反应[46]。EC 1.2.1.3还介导D-Glucurone[47]、Perillaldehyde[48]、imidazole acetaldehyde[49]的转化,这些物质均表现出一定的抗癌效果。
为了进一步探索微生物及宿主在醛脱氢酶EC 1.2.1.3中共同改变的可能机制,本研究采用Transwell共培养模型,发现长双歧杆菌显著降低了前体B型ALL细胞系NALM6中ALDH7A1的表达。细菌-细胞共培养模型被广泛应用于研究菌群-宿主互作[50-51]。Yanagibashi等[52]通过将拟杆菌、乳杆菌与淋巴细胞共培养,研究肠道菌群对淋巴细胞IgA分泌的影响。在本研究NALM6与长双歧杆菌共培养实验中,观察到了ALDH7A1表达的降低。该发现表明肠道菌群(特别是长双歧杆菌)可能通过代谢产物-宿主表观遗传调控轴,纠正ALL相关的ALDH7A1过度表达,这为开发基于微生物组的代谢干预策略提供了重要理论依据。Transwell进行长双歧杆菌与ALL细胞系NALM6共培养,可以模拟人体细胞与肠道微生物在代谢网络上的底物竞争以及代谢合作,微生物与宿主的底物竞争以及代谢合作,可能需要通过肠道吸收、血液循环的参与。未来,我们将以此为基础,进一步在动物模型、人群样本中验证该结论。通过调节肠道菌群的组成和功能,可以影响宿主细胞内同工酶的表达和活性。这些宿主同工酶在多种代谢途径中发挥关键作用,从宿主同工酶的角度出发,调节肠道菌群有望成为纠正宿主异常代谢状态的方法,可为ALL治疗提供潜在途径。
本研究为前体B型ALL中肠道菌群与宿主之间的功能相互作用提供了新的见解。观察到的菌群、代谢、宿主基因表达的协同变化,表明肠道微生物组在ALL治疗干预中的潜在作用。未来的研究应进一步探索这些相互作用的潜在机制,并开发基于微生物组的疗法,以改善ALL患者的临床结局。
利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献说明 耿锐:样本采集、分析数据、图表绘制及论文撰写;秦雪艳:样本采集、论文修订;乔晓红:课题指导、研究构想、修改审校;卢双龙:提出研究设计、修改审校论文。所有作者均阅读并同意了最终稿件的提交。
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