DOI:10.12289/j.issn.2097-4345.25088
中图分类号:R392
朱方舟， 杨宜衡， 张思雨， 贾鑫明
| 【作者机构】 | 同济大学医学院 |
| 【分 类 号】 | R392 |
| 【基 金】 | 国家自然科学基金(82371777) |
·基础研究·
人体肠道中含有大量微生物,其中包含细菌、真菌、病毒等。肠道真菌微生物群在肠道中起重要调控作用,真菌群落不稳定会导致菌群变异及肠道疾病的发生,例如炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)[1-2]。IBD是一种慢性、复发性肠道炎症疾病,主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)[3]。肠道免疫系统是维持肠道微环境稳态的关键因素,肠道对真菌病原体的识别和抗真菌免疫反应的启动主要由C型凝集素受体(C-type lectin receptor, CLRs)家族成员介导[4]。CLR作为模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRR),其主要成员包括dectin-1、dectin-2、dectin-3和mincle,这些CLRs可识别某些真菌细胞壁上表达的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),并诱导先天性和适应性免疫反应[5-6]。
白细胞介素-10(interleukin, IL-10)是一种重要的抗炎细胞因子[7-8],在维持肠道微生物-免疫平衡方面尤为重要[9],IL-10的缺失导致肠道微生物群与免疫系统之间的平衡被打破,从而诱发过度的炎症反应并促进溃疡性结肠炎的进展[10]。
白念珠菌(Candida albicans)是一种常见的条件致病菌,广泛定植于人体的多个位置,包括胃肠道、女性生殖道、口腔和皮肤等黏膜表面[11]。白念珠菌细胞壁主要由多糖和蛋白质构成,其中多糖包括甘露聚糖(mannan)、β-葡聚糖(β-glucan)和几丁质(chitin)[12],这些结构成分作为典型PAMPs,能够被宿主模式识别受体识别并激活免疫应答[13]。白念珠菌具有形态二相性,能够在酵母态和菌丝态之间转换[14]。flo8是一种正向调节白念珠菌菌丝生长的转录因子[15],其基因缺失可导致白念珠菌在相应细胞外刺激后无法由酵母态向菌丝态转变。本课题组前期研究表明,相比于野生型白念珠菌,从flo8基因缺失白念珠菌提取的甘露聚糖(flo8Δ-M)可以通过阻断未成熟CD4+CD8+T细胞凋亡诱导IL-10产生,抑制白念珠菌诱导的胸腺萎缩[16]。基于flo8Δ-M能够显著诱导IL-10产生的特性,本研究推测其可能通过调节IL-10介导的免疫应答在溃疡性结肠炎中发挥保护作用。
因此,本课题聚焦于flo8基因缺失白念珠菌甘露聚糖flo8Δ-M对于溃疡性结肠炎的保护作用及机制研究。通过阐明flo8Δ-M的调节作用,不仅有助于拓展真菌多糖在抗炎治疗领域的应用前景,也将为溃疡性结肠炎的治疗提供新的思路和潜在的治疗靶点。
雄性C57BL/6小鼠(6
8周)购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司,Clec4n基因敲除小鼠(Clec4n-/-)为实验室保存品系。本文所使用的小鼠均饲养在同济大学SPF级动物房内,所有动物实验均按照同济大学附属上海市第十人民医院动物伦理委员会批准的方案(编号: SHDSYY-2023-6263)执行。RPMI 1640培养基购自大连美仑生物技术有限公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;Prime ScriptTM RT Master Mix购自日本TaKaRa公司;2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix购自武汉爱博泰克生物科技有限公司;10% SDS-PAGE预混制胶缓冲液、Trans-Blot Turbo 5×Transfer Buffer购自美国Bio-Rad公司;IL-6、IL-10 ELISA试剂盒购自美国Thermo Fisher公司;硫酸葡聚糖钠盐(dextran sulfate sodium, DSS)购自上海易恩化学技术有限公司;p-Syk、Syk、GAPDH、Tubulin抗体购自美国CST公司;ECL发光液购自上海默克生命科学有限公司。
1.2.1 白念珠菌甘露聚糖的提取 野生型(wild type, WT)及flo8基因缺失白念珠菌接种于与YPD培养基30 ℃培养过夜。挑取菌落在YNB中30 ℃振荡培养34 h,收集菌体。采用热碱法提取甘露聚糖,具体步骤如下: 将白色念珠菌(1 g湿重)在4 mL 2%(重量/体积)NaOH溶液中混匀,100 ℃水浴加热1 h,收集上清液。新鲜配制的Feling试剂(A液: 氢氧化钠0.1 g/mL;B液: 硫酸铜0.05 g/mL)滴加到上清液中沉淀出甘露聚糖。用最小体积3 mol/L HCl溶液溶解沉淀物,随后滴加至甲醇和乙酸混合溶液(体积比8∶1)中,重复上述溶解和沉淀过程3次去除蛋白污染。随后,将沉淀物溶解在510 mL蒸馏水中,放入透析袋(截留相对分子质量: 7 000)透析24 h,收集液体冻干即得到甘露聚糖。BCA检测蛋白质水平低于0.5%,Toxin Sensor显色法LAL内毒素检测试剂盒检测内毒素浓度低于0.35 EU/mg。
1.2.2 小鼠肠炎模型的构建及甘露聚糖灌胃 小鼠平均分为两组: 甘露聚糖灌胃组和对照组(H2O灌胃),将小鼠饮用水更换为含有3%硫酸葡聚糖钠盐(dextran dulfate sodium, DDS)的饮用水,使其自由饮水,每天记录体质量变化。将从野生型白念珠菌提取的甘露聚糖(wild type Candida albicans mannan, WT-M)及flo8Δ-M溶于去离子水中,根据实验要求在适当时间点对小鼠进行灌胃,用量50 mg/kg。对照组灌胃相应体积去离子水。实验时将小鼠安乐死,取小鼠完整结肠并用标尺量取长度,表征小鼠结肠炎症程度。
1.2.3 WT及Clec4n-/-小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)的制备 从68周龄C57BL/6 WT及Clec4n-/-小鼠的股骨和胫骨中收集DC,并裂解红细胞。将BMDCs置于含有GM-CSF(20 ng/mL)的RPMI 1640完全培养基培养,4 d后补液,6 d后收集细胞进行实验[17]。
1.2.4 细胞因子检测 取肠炎小鼠的结肠,匀浆后取上清液待测。使用WT-M或flo8Δ-M刺激BMDCs 24 h,收集细胞培养上清液待测。ELISA试剂盒检测结肠组织匀浆上清、BMDCs细胞上清液的IL-6、IL-10炎症因子水平。
1.2.5 小鼠疾病活动指数(disease activity index, DAI)评估 采用国际通用的DAI评分系统,通过体质量减轻百分比、粪便性状变化、便血情况这3个指标综合评估溃疡性结肠炎严重程度。每项指标均依据其严重程度被赋予04分的评分,其中体质量减轻程度(以实验起始体质量为基线计算)、粪便从正常成形到稀水样便的转变、以及从隐血阳性到肉眼可见的直肠出血,分别反映了全身性代谢障碍、肠道炎症水肿及黏膜损伤出血的进展。最终,DAI为三项评分之和,总分为012分,分值越高表明结肠炎病情越严重。
1.2.6 Western印迹法检测 收集细胞,加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂PMSF)混匀后冰上裂解提取细胞总蛋白,进行10% SDS-PAGE电泳,完毕后将蛋白半干法电转至PVDF膜。脱脂牛奶封闭1 h,加入一抗Syk(D3Z1E)XP、Phospho-Zap-70(Tyr319)/Syk(Tyr352)、GAPDH、Tubulin(工作浓度1∶1 000)孵育过夜。16 h后PBST洗涤3遍,加入对应二抗Goat Anti-Mouse/Rabbit IgG HRP(工作浓度1∶8 000)室温孵育1 h,PBST洗涤5遍,ECL发光显影。以上抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。
1.2.7 RNA的提取及qPCR 使用TRIzol对BMDCs进行裂解,采用苯酚-氯仿法分离总mRNA。使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,作为模板。使用2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒进行qPCR实验,以GAPDH作为内参检测相关基因的表达。以GAPDH作为内参检测相关基因表达。PCR反应条件如下。预变性,95 ℃,10 min;变性,95 ℃,5 s;60 ℃,34 s;扩增40个循环。反应完成后,根据各基因的Ct值,利用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。Clec4n基因敲除小鼠鉴定:预变性94 ℃,3 min。94 ℃,10 s;65 ℃,30 s;72 ℃,1 min;扩增35个循环。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,见表1。
表1 引物序列
Tab.1 The primer sequences
基因名称引物序列(5′→3′)qPCR引物 IL-10-FATAACTGCACCCACTTC-CCAGTC IL-10-RCCCAAGTAACCCTTAAAGTCCT-GC GAPDH-FGCCTTCCGTGTTCCTACCC GAPDH-RTGCCTGCTTCACCACCTTCClec4n基因敲除小鼠鉴定引物 Clec4n-KO-FAGGTGAGAATTCCTGTCTCAGT Clec4n-KO-RATATTTCACCCTCAGGCACCT
所有统计分析及图表绘制均通过GraphPad Prism软件完成。对于两组数据间的比较,采用双侧尾t检验(two-tailed Student’s t-test)进行统计分析;而对于多组数据间的比较,首先通过单因素方差分析(one-way ANOVA)检验方差齐性,随后使用Tukey多重比较检验(Tukey’s multiple comparisons test)评估各组间的统计学差异。P<0.05为差异有统计学意义。
本课题组前期研究发现,flo8Δ-M能够显著诱导BMDCs产生IL-10抗炎因子,鉴于IL-10在肠道免疫稳态中发挥不可或缺的调节作用,推测flo8Δ-M可能对溃疡性结肠炎具有潜在的作用。本研究使用含3% DSS饮用水诱导C57BL/6小鼠建立溃疡性结肠炎模型,持续诱导7 d后,每隔1 d对实验组进行flo8Δ-M、WT-M灌胃,对照组用灭菌水灌胃。监测小鼠体质量变化发现,在诱导初期(第07天)实验组与对照组呈现相似的体质量下降趋势。使用flo8Δ-M灌胃后(第715天),实验组小鼠体质量显著恢复,而对照组小鼠体质量恢复迟缓,见图1A。初步证明,flo8Δ-M能够对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎有治疗作用。同时,WT-M实验组与对照组小鼠体质量无显著差异,见图1B。
图1 flo8Δ-M及WT-M对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎的调控作用
Fig.1 Regulatory effects of flo8Δ-M and WT-M on DSS-induced mouse ulcerative colitis
A: flo8Δ-M实验组与对照组小鼠体质量变化图;B: WT-M实验组与对照组小鼠体质量变化图;**P<0.01,***P<0.001
为进一步评估flo8Δ-M对溃疡性结肠炎的保护效应,本课题组量取了小鼠完整结肠长度。结果显示,相较于对照组,flo8Δ-M灌胃组小鼠结肠长度显著恢复,且与健康小鼠(Unsti组)的结肠长度无显著差异,见图2A、2B。同时,flo8Δ-M灌胃组小鼠DAI较对照组显著降低,见图2C,提示flo8Δ-M能够有效缓解溃疡性结肠炎临床症状。
图2 flo8Δ-M显著恢复DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎导致的炎症反应
Fig.2 flo8Δ-M markedly mitigates colonic inflammation in DSS-induced mice ulcerative colitis
A: 小鼠结肠图片;B: 小鼠结肠长度分析;C: 小鼠疾病活动指数分析;**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1,ns: P>0.05
为探究flo8Δ-M对溃疡性结肠炎保护作用的机制,本研究取小鼠结肠组织通过ELISA实验定量分析了相关炎症因子的水平。结果显示,相比于灭菌水灌胃组,flo8Δ-M灌胃后能够显著降低结肠组织中IL-6促炎因子的表达水平,显著诱导IL-10抗炎因子的产生,见图3A、3B。由此得出结论,flo8Δ-M通过诱导IL-10产生对溃疡性结肠炎有显著保护作用。
图3 flo8Δ-M显著诱导小鼠IL-10的产生
Fig.3 flo8Δ-M significantly induces the production of IL-10 in mice
A、B: ELISA检测小鼠结肠组织IL-6、IL-10水平;*P<0.05,***P<0.001
为进一步探究flo8Δ-M对于溃疡性结肠炎保护作用的分子机制,分离小鼠BMDCs,使用WT-M和flo8Δ-M分别刺激BMDCs 0、30、60 min,Western印迹法检测脾脏酪氨酸激酶(Syk)表达情况。结果显示,flo8Δ-M能够显著诱导Syk的磷酸化,见图4A,同时显著诱导BMDCs分泌IL-10,并上调IL-10的mRNA表达水平,见图4B、4C。这些结果表明,Syk在flo8Δ-M诱导IL-10产生中起重要调控作用。已有许多研究报道,Dectin-2作为C型凝集素受体,能够识别甘露聚糖并激活Syk及下游信号通路[18]。因此假设Dectin-2是识别flo8Δ-M调控Syk通路的关键受体。为验证这一假设,本课题组从Clec4n基因敲除的小鼠中分离BMDCs(Clec4n-/- BMDCs)。结果显示,Dectin-2的缺失完全阻断了Syk的磷酸化、IL-10的分泌以及IL-10的mRNA表达,见图4D4F。综上,本研究证实,flo8Δ-M通过Dectin-2-Syk信号通路诱导BMDCs产生IL-10。
图4 flo8Δ-M通过Dectin-2-Syk诱导产生IL-10
Fig.4 flo8Δ-M induces IL-10 production through the Dectin-2-Syk signaling pathway
A: Western印迹法检测WT小鼠BMDCs磷酸化Syk水平;B: ELISA检测WT小鼠BMDCs的IL-10表达水平;C: qPCR检测WT小鼠BMDCs的IL-10表达;D: Western印迹法检测Clec4n基因敲除小鼠BMDCs细胞磷酸化Syk水平;E: ELISA检测flo8Δ-M刺激BMDCs的IL-10表达水平;F: qPCR检测flo8Δ-M刺激BMDCs的IL-10的mRNA表达;**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1
最后为验证Dectin-2的关键调控作用,本研究使用Clec4n基因敲除小鼠(Clec4n-/-)构建溃疡性结肠炎模型,并以WT小鼠为对照。在DSS诱导结束后使用flo8Δ-M灌胃,灭菌水灌胃作为对照组。结果表明,Dectin-2的缺失显著阻断flo8Δ-M灌胃引起的小鼠体质量恢复,见图5A。并且通过评估结肠长度、IL-10产生水平、DAI,发现Dectin-2的缺失会导致flo8Δ-M对于溃疡性结肠炎的保护作用完全消失,见图5B、5C、5D。综上,本研究证明flo8Δ-M通过Dectin-2信号通路在溃疡性结肠炎中发挥保护作用。
图5 flo8Δ-M通过Dectin-2信号通路在溃疡性结肠炎中的调控作用
Fig.5 flo8Δ-M exerts regulatory effects in ulcerative colitis via the Dectin-2 signaling pathway
A: flo8Δ-M灌胃WT、Clec4n基因敲除肠炎小鼠各组小鼠体质量变化;WT+H2O组与WT+flo8Δ-M组相比,*P<0.05,**P<0.001,WT+H2O组与Clec4n-/-+H2O组相比,##P<0.01;B: WT、Clec4n基因敲除小鼠结肠长度分析,**P<0.01,***P<0.01;C: WT、Clec4n基因敲除小鼠IL-10表达量分析,*P<0.05;D: WT、Clec4n基因敲除小鼠DAI分析,*P<0.05,**P<0.01
在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中,实验动物通常表现为体质量减轻、腹泻和粪便隐血等典型症状[19-20]。本研究通过灌胃给予WT-M、flo8Δ-M,结果显示WT-M对于3%DSS诱导的溃疡性结肠炎无显著保护作用,进一步系统评估了flo8Δ-M灌胃小鼠的体质量变化、结肠长度、DAI、细胞因子分泌水平等多项指标结果显示,flo8Δ-M处理组上述指标均显著优于对照组,提示flo8Δ-M对DSS诱导的溃疡性结肠炎具有显著的保护作用。这一发现与本课题组前期研究结果相吻合,即flo8Δ-M能够通过刺激固有免疫细胞产生高水平的IL-10来下调炎症反应[16]。此外,肠道微生物群在flo8Δ-M干预后的动态变化及其对疾病进程的影响也值得进一步研究。鉴于已有研究表明,香菇多糖能够调控IL-10和TGF-β等关键细胞因子的表达[21],因此推测flo8Δ-M可能具有潜在的抗肿瘤作用,这一假设需要通过后续实验加以验证。通过进一步阐明其作用机制并探究其结构与功能,真菌多糖类化合物有望在炎症性疾病和肿瘤治疗领域发挥更加重要的作用[22-24]。
C型凝集素受体Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3和mincle等可识别到白念珠菌细胞壁β-葡聚糖、α-甘露聚糖,从而启动对病原真菌的先天性和适应性免疫反应[25]。脾脏酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase, Syk)是一种非受体型酪氨酸激酶,主要在造血细胞中表达,并在免疫受体信号传导中发挥关键作用[26-27]。典型的CLR信号转导始于Syk的磷酸化激活。本课题组前期研究发现,宿主免疫细胞表面的C型凝集素受体Dectin-2能够特异性识别α-甘露聚糖,α-甘露聚糖促进Dectin-2与Dectin-3形成异源二聚体,增强Syk信号通路的激活,从而调控宿主抗白念珠菌免疫[28]。本研究表明,flo8Δ-M能够有效刺激BMDCs激活Syk信号通路,导致Syk的磷酸化。通过Clec4n基因敲除小鼠,进一步证明Dectin-2参与识别flo8Δ-M并调控Syk激活,对于溃疡性结肠炎产生保护作用。先前的实验表明,flo8Δ-M能够被多种CLRs识别,不排除其他受体参与识别flo8Δ-M并调控溃疡性结肠炎,这也是后续的研究重点。此外,研究发现Syk在多种肿瘤中异常表达,并通过调控肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭和转移,影响肿瘤进展[29]。因此,flo8Δ-M对Syk通路的调控在抗肿瘤领域也有重要的研究意义。
综上所述,在本研究通过建立经典的小鼠溃疡性结肠炎模型,系统性评估小鼠各项指标,证明flo8Δ-M对于溃疡性结肠炎有显著保护作用。从机制上讲,flo8Δ-M通过Dectin-2-Syk通路诱导IL-10产生,从而发挥其对溃疡性结肠炎的调控作用。这一发现不仅证实了flo8Δ-M在溃疡性结肠炎模型中独特的免疫调节功能,也为溃疡性结肠炎的治疗提供了新的思路和潜在的治疗靶点。未来研究将进一步探索flo8Δ-M在肿瘤治疗中的潜在应用价值,为开发基于真菌多糖的新型治疗策略提供理论依据。
利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献说明 朱方舟: 设计实验、实验操作、数据处理、论文撰写;杨宜衡: 实验设计、论文指导;张思雨: 实验操作、数据处理;贾鑫明: 课题设计、论文审阅与指导。
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