DOI:10.12289/j.issn.2097-4345.25395
中图分类号:R714.21
高诣婕1， 孟璐璐1， 冯晓琬2， 王子诺1， 汝萍1， 刘云1， 王凌1， 倪晓田1， 刘铭1
| 【作者机构】 | 1同济大学附属东方医院产科； 2锦州医科大学基础医学院 |
| 【分 类 号】 | R714.21 |
| 【基 金】 | 上海市浦东新区卫生系统重点专科建设项目(PWZzk2022-11) 上海市浦东新区高峰高原学科建设临床医学新质专科(专病)项目(2024-PWXZ-15) |
·基础研究·
早产为妊娠满28周不足37周分娩。我国早产发生率约为7.1%[1],每年全球约有1 340万早产儿出生,占活产总数的9.9%[2],早产是全球5岁以下儿童死亡的首要原因[3]。早产由感染、子宫结构异常、多胎妊娠、心理社会因素等多因素交互作用,还有许多早产病例无法明确病因[4]。早产及分娩启动的发生机制尚未完全阐明,使早产的防治出现了瓶颈。缓激肽是一种具有广泛生物学效应的活性九肽,在多种病理生理过程中发挥关键调控作用,包括炎症反应介导、组织损伤修复、血管张力调节以及疼痛感知等[5]。本研究拟通过早产大鼠模型,结合转录组分析,探究缓激肽在宫颈重塑中的作用机制,为早产防治提供新靶点。
本研究采用10周龄Sprague-Dawley雌性大鼠,体质量(250±50) g,在标准条件下,温度(22±2) ℃,湿度50%±10%,12 h光/暗循环饲养,在动情期与雄性大鼠合笼交配,次日晨检见阴道栓记为妊娠第1天(D1)。将孕鼠随机分为: 早产组(LPS组,n=18)于第17天(D17)腹腔注射100 μg/kg脂多糖(lipopolysaccharide, LPS);对照组(PBS组,n=18)腹腔注射等体积磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline, PBS)。动物实验程序经同济大学医学研究伦理委员会批准,伦理编号: 【2022】研审第(110)号。
LPS(货号: L2880)购自美国Sigma-Aldrich公司,RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(货号: DP451)购自天根生化科技(北京)有限公司,第一链cDNA Synthesis Super Mix for RT-qPCR(货号: F0202)和2×Realab Green PCR Fast mixture通用型(货号: R0202)购自北京兰博利德商贸有限公司,qRT-PCR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司,序列见表1。
表1 qRT-PCR引物
Tab.1 Primers for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR) analysis
基因序列COL3A1-F5′-TTCCTGGGAGAAATGGCGAC-3′COL3A1-R5′-ACCAGCTGGGCCTTTGATAC-3′IL-6-F5′-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3′IL-6-R5′-TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3′KNG1-F5′-TGAGTTGGTTTCCCTTTTTGGC-3′KNG1-R5′-GGGGTACACAGTCTTCACGG-3′LOX-F5′-GGGTGCATAGTGGGCTCTTT-3′LOX-R5′-TTCGCTGTGCTGTGAATCCT-3′MME-F5′-TCTGTTTGGTGACCGAGAGC-3′MME-R5′-ACATTGCGTTTCAACCAGCC-3′MMP9-F5′-GATCCCCAGAGCGTTACTCG-3′MMP9-R5′-GTTGTGGAAACTCACACGCC-3′PTGS2-F5′-TACGAAGACCCTGCCTACGA-3′PTGS2-R5′-GGGTGGGCTTCAGCAGTAAT-3′TNF-α-F5′-CAAGGACAGCAGAGGACCAG-3′TNF-α-R5′-TCCTTTCCAGGGGAGAGAGG-3′β-Actin-F5′-AACACAGTGCTGTCTGGTG-3′β-Actin-R5′-GTAACAGTCCGCCTAGAAGC-3′
给药12 h后取母鼠宫颈组织(LPS组,n=4;PBS组,n=4),-80 ℃保存,采用Total RNA Extraction Kit 2.0 Plus依照说明书提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific, USA)鉴定RNA纯度和定量,使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)评估RNA完整性。使用VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep试剂盒依照说明书构建转录组文库。转录组测序和分析由上海欧易生物技术有限公司进行。
采用Illumina Novaseq 6000测序平台对文库进行测序,并生成150 bp双端reads。每个样本大约获得25M raw reads。采用fastp软件对fastq格式的raw reads进行处理,去除低质量reads后获得clean reads用于后续数据分析。使用HISAT2软件进行参考基因组比对,参考基因组为大鼠rn7版本(mRatBN7.2),并进行基因表达量(FPKM)计算,并通过HTSeq-count获得每个基因的reads计数(counts)。使用R软件(v3.2.0)对基因(counts)进行PCA分析以及绘图,以评估样本生物学重复。转录组测序原始数据已上传至NCBI GEO数据库(登录号: GSE307173)。
使用DESeq2软件进行差异表达基因分析,其中符合Q值<0.05且差异倍数(fold change, FC)>2或<0.5阈值的基因被定义为差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。使用R软件(v3.2.0)对DEGs进行层次聚类分析,以展示基因在不同组和样本中的表达模式。使用R包ggradar对Top 30基因绘制雷达图,以展示上调或下调基因的表达变化情况。
随后,基于超几何分布算法对差异表达基因进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)Pathway富集分析,用于筛选显著性富集功能条目。采用Rv3.2.0对显著性富集功能条目绘制柱形图、和弦图或富集分析圈图。
依照说明书提取宫颈组织总RNA,与转录组测序样本总RNA,均反转录为cDNA,反应条件: 37 ℃ 2 min,55 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min,将获得的cDNA置于冰上用于后续实验,或-20 ℃保存。PCR反应条件: 95 ℃ 30 s预变性,95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s共40个循环。利用2-ΔΔCt法计算目的基因相对于内参基因(β-actin)的相对表达量。
使用SPSS 20.0软件分析实验结果,GraphPad Prism 8.0.1绘制图表。使用Kolmogorov-Smirnov检验评估数据的正态性,正态分布的计量资料用均值±标准差
表示,组间比较采用Student’s t检验,计数资料用百分率表示,采用Pearson’s chi-squared检验。所有统计结果取双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。
SD大鼠的妊娠期约为21
23 d,妊娠20 d及之前分娩为早产,妊娠第1722天相当于人的妊娠晚期,此阶段胎儿器官接近成熟。本研究在SD大鼠妊娠17 d时腹腔注射LPS(100 μg/kg),以构建大鼠早产模型(LPS组,n=18),腹腔注射相同体积无菌PBS作为对照(PBS组,n=18)。腹腔注射12 h后收集母鼠宫颈组织,部分进行转录组测序(每组4只),部分提取宫颈组织总RNA用于qRT-PCR(每组8只),其余孕鼠继续饲养观察分娩结局(每组6只),处理流程见图1A。腹腔注射LPS导致所有孕鼠出现早产,腹腔注射PBS后所有孕鼠均足月分娩,早产率PBS组0%(0/6),LPS组100%(6/6),差异有统计学意义(χ2=12.0,P=0.000 5),见图1B;与PBS组相比,LPS组的大鼠妊娠期更短[(PBS(21.92±0.58) d vs LPS(18.08±0.38) d,P<0.000 1],见图1C。
图1 构建大鼠早产模型
Fig.1 Establishment of a rat model of preterm birth
A: SD大鼠在妊娠第17天腹腔注射给药,12 h后收集母鼠宫颈组织,部分进行转录组测序(每组4只),部分进行qRT-PCR(每组8只),其余孕鼠观察分娩结局(每组6只);B: 孕鼠早产率比较;C: 孕鼠平均妊娠期比较,P<0.000 1;i.p.: 腹腔注射
为了探究腹腔注射LPS作用于大鼠宫颈组织诱发早产的潜在分子机制,本研究对LPS组(n=4)与PBS组(n=4)的转录组数据进行DEG分析。以|log2 FC|>1、Q<0.05作为差异表达基因的筛选阈值,发现在早产大鼠宫颈中有892个基因显著上调、725个基因显著下调,见图2A。在宫颈组织中LPS处理改变了多种基因表达: 早产相关基因(如ADRB2、CSF2、HSPA5、EBF),宫颈重塑相关基因(如ADAMTS16、COL11A1、MMP9),炎症相关基因(如CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCR1、CCR2、CCR5、CD14、AIF1、CHI3L1、CXCL1、CXCL2、IL-6、IL-1β、PTGS2),缓激肽系统相关基因(如KNG1、MME),经典补体激活途径相关基因(如C2、C3、CD8A、CD8B),MAPK信号通路相关基因(如MAP3K13、MAP3K8、MAPK11、MAPK15),JAK-STAT信号通路相关基因(如STAT1、STAT2、STAT4),NF-κB信号通路相关基因(如TLR6、TLR7、NFKB2、NFKBIE、NLRP3、BCL3),PI3K-AKT信号通路相关基因(如PIK3AP1、PIK3CG),见图2B、C。DEG分析结果表明,孕期炎症反应引发的早产与宫颈重塑、缓激肽系统有密切关系。
图2 LPS处理改变了孕鼠宫颈组织的基因表达
Fig.2 LPS treatment modifies gene expression in cervical tissues of pregnant rats
A: 差异基因柱状图;B: 差异基因热图;C: 差异基因火山图
进一步分析LPS处理对大鼠宫颈组织差异基因功能的影响,包括GO分析和KEGG分析。
GO富集分析结果显示,在生物过程(biological process, BP)类别中,显著富集的GO术语包括对细菌的反应、炎症反应、对LPS的反应、细胞对LPS的反应、免疫反应、中性粒细胞趋化作用、先天免疫反应、对细菌的防御反应、对病毒的防御反应、趋化因子介导的信号通路;以上通路与免疫系统激活、炎症过程相关。在细胞组分(cell component, CC)类别中,显著富集的GO术语包括细胞外空间、质膜外侧、细胞表面、细胞外区域、细胞外基质、膜、膜筏、质膜、顶质膜、基底外侧质膜;细胞外基质是宫颈的主要组成部分,炎症反应可能导致细胞外基质的降解和重塑,影响宫颈的力学性能,增加宫颈机能不全风险,引发早产。在分子功能(molecular function, MF)类别中,显著富集的GO术语包括趋化因子活性、氧结合、钙离子结合、肽抗原结合、氧载体活性、信号受体活性、CXCR趋化因子受体结合、丝氨酸型内肽酶抑制剂活性、肝素结合、CCR趋化因子受体结合,见图3A;上述通路影响细胞通信、免疫反应和炎症反应。上述GO分析显示炎症反应和免疫系统激活可能通过改变细胞外基质导致宫颈结构损伤和功能障碍,最终导致早产。
图3 LPS处理改变了孕鼠宫颈组织的基因功能
Fig.3 LPS treatment modifies gene function in cervical tissues of pregnant rats
A: 差异基因GO富集分析柱状图,横轴数值为显著P值(P<0.05)的负对数转换,转换后的值越大则此功能类型的富集越显著;B: 上调差异基因KEGG通路富集分析气泡图;C: 下调差异基因KEGG通路富集分析气泡图: 气泡直径大小与该通路涉及到的差异基因数目成正相关,气泡颜色由蓝-白-黄-红变化,其富集P值越小显著程度越大;BP: 生物过程,CC: 细胞组分,MF: 分子功能,CellP.: 细胞过程,EnvIP.: 环境信息处理,HumaD.: 人类疾病,Metab.: 代谢,OrgaS.: 生物体系统
KEGG富集分析结果显示,统计学差异最显著的前20个上调KEGG通路中和炎症、缓激肽相关的包括: 细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性,见图3B。统计学差异最显著的前20个下调KEGG通路中和宫颈机能不全相关的有细胞外基质-受体相互作用,和早产有关的有钙信号通路、cAMP信号通路、造血细胞谱系、PI3K-AKT信号通路,见图3C。上述KEGG通路可能通过调控炎症反应及缓激肽系统,破坏细胞外基质的稳定,诱发宫颈机能不全相关疾病,导致早产发生。
本次转录组数据分析表明,在LPS处理的孕鼠宫颈中,调节宫颈重塑的多个关键基因显著改变,见表2,其中尽管COL3A1的log2 FC为0.60(Q<0.01),但因其在宫颈细胞外基质中的关键作用,仍被纳入关键基因进行验证。借助qRT-PCR对两组孕鼠的宫颈进行检测,结果显示,与对照组相比,LPS组中炎症相关的IL-6、TNF-α基因表达上调,细胞外基质相关的COL3A1、LOX、MMP9基因表达上调,宫颈重塑相关的PTGS2基因表达上调,缓激肽相关的KNG1、MME基因表达上调,见图4,以上结果均与转录组数据相符合。
图4 LPS对孕鼠宫颈重塑相关基因的影响
Fig.4 LPS treatment alteres the expression of cervical remodeling-related genes in pregnant rats
qRT-PCR检测PBS组(n=12)和LPS组(n=12)孕鼠宫颈IL-6(A)、TNF-α(B)、COL3A1(C)、LOX(D)、MMP9(E)、PTGS2(F)、KNG1(G)、MME(H)的基因表达,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1
表2 转录组测序宫颈重塑相关关键基因表达
Tab.2 Key cervical remodeling-related genes identified by RNA sequencing
基因log2 FCQ变化趋势IL-63.78<0.05上调TNF-α1.99<0.0001上调COL3A10.60<0.01上调LOX1.85<0.0001上调MMP97.03<0.0001上调PTGS21.03<0.05上调KNG16.69<0.0001上调MME1.23<0.0001上调
本研究通过构建LPS早产大鼠模型,结合转录组测序分析及qRT-PCR实验来探索炎症诱发宫颈重塑异常导致早产的可能机制。本研究发现,炎症诱发宫颈组织早产、宫颈重塑、炎症、缓激肽相关基因表达以及经典补体、MAPK、JAK-STAT、NF-κB、PI3K-AKT信号通路的改变;炎症因子可能激活缓激肽系统,两者协同作用导致宫颈细胞外基质结构紊乱和功能障碍,最终导致早产。
宫颈重塑指妊娠期间宫颈结构与功能的动态调整过程,包含软化、成熟、扩张、修复四阶段,使宫颈从紧密、结构性屏障转化为柔软、顺应性结构[6]。宫颈细胞外基质结构完整性对维持妊娠至关重要,宫颈细胞外基质中胶原占主导地位。主要为Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ, COL1A1)和Ⅲ型胶原蛋白(collagen type Ⅲ, COL3A1),其交联结构决定组织刚性和抗张强度。赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)催化胶原蛋白交联,增强纤维稳定性[7]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)如MMP9、MMP14、MMP2等介导细胞外胶原降解[8]。正常妊娠分娩前宫颈重塑过程中LOX表达下降、MMPs合成和激活,导致胶原蛋白交联下降并解构[9]。早产宫颈重塑过程中宫颈MMPs胶原酶活性增加,导致胶原堆积无序,胶原纤维分散增加,纤维间距更大[10]。既往宫颈机能不全或孕中期宫颈短的女性宫颈胶原蛋白浓度降低[11]。因此妊娠未足月时发生MMPs上升、LOX下降可能导致宫颈胶原异常(排列混乱或数目下降),导致宫颈承托力下降、宫颈机能不全,最终发展为自发性早产。另一方面,炎症也可诱发早产。LOX参与各种炎症疾病,如在糖尿病、骨质疏松和类风湿关节炎等疾病中,TNF-α可通过VEGF、Fak、miR203、TNF-α受体和PKC抑制LOX,在心肌纤维化和食管炎中,TNF-α可通过TGF-β/PI3K通路、NF-κB/TGF-β通路上调LOX;其余炎症因子如IL-1β、IL-4、IL-6 和 IFN-γ在不同疾病中也可上调或下调LOX表达[12]。在早产炎症环境中,LOX表达也有组织特异性,早产未临产孕妇胎膜LOX表达高于足月未临产孕妇的,胎盘的绒毛合体滋养层和细胞滋养层相近[13]。在未足月胎膜早破炎症环境中,氧化应激引起孕妇绒毛膜和羊膜的LOX表达显著升高[14]。本研究中早产大鼠宫颈组织中MMP9、LOX、COL3A1基因表达均升高,可能因为造模时使用LPS诱发宫内炎症,而在炎症环境可能刺激宫颈组织表达LOX;也可能因为宫颈组织代偿性上调LOX和COL3A1来增强细胞外基质的强度,以对抗MMP9介导的胶原蛋白降解。然而MMP9过度活跃无法长时间维持稳态,失代偿后LOX和COL3A1反弹性下降,胶原减少并解构,导致宫口扩张引发早产。本研究的采样时间在LPS刺激后12 h,可能正处于代偿阶段。进一步的体外细胞实验发现,LPS刺激后LOX与COL3A1的表达呈现先升高后降低的动态变化趋势,而MMP9则持续高表达,这一表现支持了“早期代偿-后期失代偿”的观点。
前列腺素内过氧化物合酶 2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2, PTGS2)是催化花生四烯酸转化为前列腺素前体的关键酶,宫颈间充质细胞可合成其下游产物前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2),在介导宫颈组织变化、促进宫颈成熟中发挥核心作用,如: (1) 增加宫颈基质细胞MMP1、MMP9的表达;(2) 增加宫颈局部炎症因子IL-8、TNF-α、IL-1β的分泌;(3) 加速孕酮在宫颈局部的代谢;(4) 促进宫颈局部促肾上腺皮质激素释放激素的产生;(5) 与EP4结合介导宫颈水肿的过程等[15]。这与本研究中早产孕鼠的宫颈组织PTGS2、IL-6、TNF-α等炎症因子表达上升相符。
激肽释放酶降解激肽原生成缓激肽(bradykinin, BK),羧肽酶作用于BK的C端精氨酸残基生成去精氨酸缓激肽(Des-Arg9- bradykinin, DABK)。激肽原1(kininogen 1, KNG1)可编码高分子量激肽原和低分子量激肽原,高分子量激肽原是缓激肽的前体蛋白之一[16]。膜金属内肽酶(membrane metall-oendopeptidase, MME)是一种中性内肽酶,可降解缓激肽[17]。BK主要激活缓激肽受体B2(bradykinin receptor B2, BDKRB2),为组成型表达,介导急性炎症反应;DABK激活缓激肽受体B1(bradykinin receptor B1, BDKRB1),为诱导型受体,在组织损伤或炎症时表达上调[18]。BDKRB1是参与炎症调节的重要蛋白,在急性炎症时,局部生成的缓激肽产物DABK结合BDKRB1,促进PGE2、IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达[19]。缓激肽可以直接作用于发情期大鼠的全子宫和子宫肌层,引起子宫平滑肌的强烈收缩[20]。孕晚期给予大鼠缓激肽系统抑制剂抑肽酶可以出现分娩延迟的现象[21],提示缓激肽系统可能参与孕晚期分娩发动。本研究中LPS诱导的炎症环境中KNG1表达增加,从而刺激缓激肽产生,而MME可能反馈性上调以加速缓激肽降解,维持体内平衡。然而,LPS调控缓激肽系统的具体分子机制尚不明确,特别是两者如何通过协同或独立作用影响PTGS2/PGE2通路,进而介导宫颈重塑并最终导致分娩启动,仍需深入探索。本研究主要通过qRT-PCR在mRNA水平验证上述关键基因表达,未来可通过Western印迹法等技术在蛋白水平进一步验证。
综上所述,本研究通过构建LPS诱导的大鼠早产模型,系统地阐明了炎症反应与宫颈重塑异常导致早产之间的联系,并初步揭示了其潜在的分子机制。研究发现,LPS通过激活炎症、宫颈重塑相关基因以及缓激肽系统,协同调控PTGS2/PGE2通路,进而影响细胞外基质稳定性,最终诱发早产。这些结果为解释炎症环境下宫颈功能紊乱导致早产的机制提供了新的证据,也为进一步解析感染、免疫异常等因素引发自发性早产的分子机制提供了参考,为早产的预测和干预策略开发奠定了理论基础。
利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献说明 高诣婕: 负责实验主要设计、实施、数据分析及论文初稿撰写;孟璐璐、冯晓琬、王子诺: 参与实验操作、数据采集与分析;汝萍、刘云、王凌: 参与部分实验及数据整理;倪晓田、刘铭: 负责研究总体指导、构思与设计、经费支持及论文审阅与定稿。
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