口腔黏膜炎(chemotherapy induced-oral mucositis, CIOM)是一种发生在癌症患者化疗后的口腔黏膜炎症和溃疡性病变[1]。口腔黏膜炎的发生率和严重程度取决于癌症患者接受的治疗方式。在接受化疗的癌症患者中,约有40%的患者发生口腔黏膜炎,而接受放疗和化疗的头颈部癌症患者的发病率高达90%[2]。抗肿瘤药物主要通过多种机制发挥细胞毒性作用,导致DNA复制和修复障碍、细胞周期阻滞、DNA损伤和细胞死亡。口腔黏膜细胞更新速率快,对化疗药物更敏感。CIOM通常发生在化疗开始后35 d,症状在2周内达到高峰,一般在化疗后21 d内消失,主要表现为嘴唇、颊黏膜、软腭、舌缘和舌腹等非角化黏膜的红斑,随后发展为溃疡和萎缩,常伴有假膜形成。CIOM的发病机制尚不清楚。目前,一种涉及直接损伤DNA和黏膜、产生活性氧、激活转录因子以及产生和释放促炎细胞因子的五阶段模型已得到广泛认可[3]。CIOM可影响患者的生活质量,严重影响其营养摄入,进而影响其耐受性和对化疗的依从性,从而危及生命。目前尚无有效的治疗方法[4]。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有多向分化、低免疫原性、自我更新等生物学潜能[5]。它们具有多种生物学特性,包括抑制炎症和促进组织修复,成为再生医学和组织工程的种子细胞。已有研究对骨髓MSCs进行了探索,验证了其在修复糖尿病足溃疡、外伤性皮肤缺损和烧伤造成的严重软组织缺损等难愈性创面修复中的有效性,为临床提供了一种可行的治疗方法[6-9]。

脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)因其可非侵入性获取、低免疫原性和较少的伦理问题而被认为是最有发展潜力的干细胞疗法之一。与胚胎干细胞和诱导多能性干细胞相比,作为成体干细胞,ADSCs具有更高的安全性。本研究采用化疗性口腔黏膜炎的小鼠模型,在病变部位注射小鼠ADSCs(mouse ADSCs, mADSCs);观察mADSCs对CIOM的治疗作用,初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

1.1.1 实验动物 68周龄雌性C57BL/6小鼠购自上海南方生物模式生物科技股份有限公司,于12 h光照/12 h黑暗循环、可自由获取食物和水的环境下饲养1周。所有动物实验均经同济大学动物伦理委员会批准(伦理编号: TJBD00623101)。

1.1.2 主要试剂 Ⅰ型胶原酶购自美国Sigma公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;mADSCs成脂分化试剂盒购自中国赛业生物科技有限公司;H-E染色试剂盒购自中国上海威奥生物科技有限公司;兔源IL-6多克隆抗体购自美国Affinity公司;AlexaFluor488山羊抗兔IgG(H+L)购自中国上海碧云天生物技术有限公司;TRIzol、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司;PCR引物购自中国上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠CIOM模型的建立 68周龄雌性C57BL/6小鼠30只,随机分为空白对照组、5-FU组,ADSCs治疗组。每组10只小鼠。在实验第1、3和5天,5-FU组和ADSCs治疗组接受5-FU溶液腹腔注射(50 mg/kg,浓度0.5%)。第5天,分别用2%戊巴比妥钠麻醉5-FU组和ADSCs治疗组小鼠,用70%乙酸浸泡的圆形滤纸(直径1.5 mm)贴于舌前1/3处30 s。第6天,采用五点注射法进行治疗: 空白对照组给予0.5 μL PBS(每只小鼠共计2.5 μL);5-FU组给予等量的PBS;ADSCs组给予0.5 μL的mADSCs细胞悬浮液(每只小鼠1×106细胞)。

1.2.2 mADSCs的分离 采集C57BL/6小鼠脂肪组织,PBS清洗后Ⅰ型胶原酶在37 ℃的条件下消化组织1 h,间歇摇晃。用含有10%胎牛血清的DMEM清洗组织,1 000 r/min离心5 min(离心半径17.3 cm),以去除成熟的脂肪细胞。用10% FBS和1%青霉素/链霉素悬浮于DMEM中,在37 ℃、5%体积分数CO2培养箱中培养。贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA溶液传代34次。

1.2.3 mADSCs成脂诱导及鉴定 按照mADSCs成脂分化试剂盒的方法,6孔细胞培养板每孔涂1 mL 0.1%明胶,干燥30 min。然后将mADSCs植入培养基中,细胞达到100%融合时,更换为脂肪分化培养基A(诱导培养基)。诱导3 d后,更换为成脂分化培养基B(维持培养基)。维持1 d后,换为诱导培养基。细胞分化3周后,去除原培养基,用PBS清洗3次。细胞在室温下用4%多聚甲醛固定30 min。去除多聚甲醛,PBS清洗3次,室温下油红O工作液染色。然后去除染色液,在每个孔中加入PBS,在显微镜下观察油红O染色效果。

1.2.4 mADSCs成骨诱导及鉴定 6孔细胞培养板每孔涂1 mL 0.1%明胶,干燥30 min。然后将培养板中的细胞植入培养基中,当细胞融合率达到70%时,加入成骨分化培养基,每3 d更换一次培养基。诱导3周后,在孔中可见矿化结节。室温下4%多聚甲醛固定30 min后,用PBS对细胞进行3次清洗。去除多聚甲醛后,用PBS再洗3次,用茜素红工作液在室温下染色10 min。然后,用PBS清洗细胞,在显微镜下观察茜素红染色,并在每孔中加入2 mL PBS。

1.2.5 mADSCs表面标志物评价 当第三代mADSC融合达到90%时,将原始培养基吸出,用PBS缓冲液清洗细胞。随后,用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞并转移到4 mL的EP管中。室温条件下,将细胞离心5 min,丢弃上清液,在4 ℃预冷的流式细胞仪缓冲液中重新悬浮细胞。细胞悬浮液经70 μm细胞筛过滤,室温下1 000 r/min离心5 min(离心半径17.3 cm)。细胞在流式细胞仪缓冲液中再次悬浮,细胞密度调整为1×106/mL。在每个1.5 mL的EP管中加入100 μL的上述细胞悬液。在黑暗条件下,将相应的抗体APC-CD29、FITC-CD44和FITC-CD45加入细胞悬浮液中,充分混合,在黑暗中培养30 min。培养完成后,将4 ℃ 3 000 r/min离心5 min(离心半径17.3 cm),丢弃上清液,每管加入1 mL流式细胞仪缓冲液,充分混合。洗涤过程重复2次。将500 μL的PBS缓冲液加入每个EP管,使细胞重新悬浮,然后将其转移到流式细胞仪检测。

1.2.6 组织学及免疫组织化学染色 病变区域的舌组织在室温下于4%多聚甲醛中固定至少24 h。固定完成后,石蜡包埋组织,并切成4 μm的切片用于染色。组织切片苏木精染色5 min后伊红染色15 s,封片后用于病理学观察。组织切片在室温下与一抗兔抗Nrf2和兔抗Keap1孵育1 h。在此之后,切片与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗共同孵育进行免疫组织化学染色。

1.2.7 口腔黏膜炎指数及病理学评分标准 口腔黏膜炎的评估采用双重评分方法,包括大体观察和病理学检查两部分。大体观察通过口腔黏膜炎指数(oral mucositis index, OMI)将病变分为4个等级: 1分表示口腔黏膜无异常,2分表现为中度红斑和充血伴点状糜烂,3分显示严重红斑/充血伴出血及小范围溃疡,4分对应大面积溃疡伴脓肿的严重病变。病理学评分进一步细化了组织学特征: 1分为正常结构,2分出现轻度血管扩张或炎症浸润,3分可见上皮水肿和大量炎症浸润伴溃疡,4分为出现重度血管扩张及脓肿。

1.2.8 实时荧光定量聚合酶链反应 提取并修剪各组小鼠舌黏膜组织样本,使用TRIzol试剂按照制造商的说明提取总RNA,经反转录试剂盒反转录为cDNA后,以GAPDH为内参,检测IL-1β、IL-6、TNF-α、HO-1、SOD-1、Nrf2和Keap1的mRNA表达,引物序列见表1。PCR反应条件为预变性95 ℃ 30 s;变性95 ℃ 5 s;退火/延伸60 ℃ 31 s,40次循环。每个样品重复3次,使用标准的2-ΔΔCt方法进行计算。

表1 引物序列
Tab.1 Primer sequence

名称序列(5′→3′)来源IL-1β-FGCAACTGTTCCTGAACTCAACTNCBIIL-1β-RATCTTTTGGGGTCCGTCAACTNCBIIL-6-FTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCCNCBIIL-6-RTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCNCBITNF-α-FCAGGCGGTGCCTATGTCTCNCBITNF-α-RCGATCACCCCGAAGTTCAGTAGNCBIHO-1-FAAGCCGAGAATGCTGAGTTCANCBIHO-1-RGCCGTGTAGATATGGTACAAG-GANCBISOD-1-FAACCAGTTGTGTTGTCAGGACNCBISOD-1-RCCACCATGTTTCTTAGAGTGAGNCBINrf2-FTCTTGGAGTAAGTCGAGAAGT-GTNCBINrf2-RGTTGAAACTGAGCGAAAAAGGCNCBIKeap1-FCAGCTACACACTAGAGGATCA-CANCBIKeap1-RGTGGATGCCTTCGATGGACANCBIGAPDH-FGCCTCCTCCAATTCAACCCTNCBIGAPDH-RCTCGTGGTTCACACCCATCANCBI

1.3 统计学处理

本实验中的所有数据均采用单因素方差分析,涉及2个以上独立样本的比较时采用Tukey检验进行分析,并使用GraphPad Prism 9.0版本进行处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 mADSCs分离、培养与鉴定的结果观察

分离培养mADSCs后,使用脂肪分化试剂盒诱导分化3周。细胞形态由梭形变为不规则形,细胞质中出现葡萄状脂滴。油红O染色显示细胞内有大小不一的多个红色脂滴,见图1A。使用成骨分化试剂盒诱导成骨分化3周后,观察到钙盐沉积,茜素红染色显示红色矿化结节,见图1B。流式细胞术结果表明,mADSCs的表面标志物CD29(99.88%)和CD44(98.76%)呈阳性,而CD45(0.57%)呈阴性,证实体外分离的原代mADSCs具有MSCs的特征,见图1C。

图1 小鼠脂肪源性干细胞的分离、培养与鉴定的结果观察
Fig.1 Observation on the results of isolation, culture and identification of adipose-derived stem cells from mice

A: 脂肪诱导分化21 d mADSCs中脂滴的形成(油红O染色,×200);B: 成骨诱导分化21 d mADSCs中矿化结节的形成(茜素红染色,×200);C: 流式细胞术检测mADSCs表面标志物CD29、CD44和CD45的表达

2.2 mADSCs促进CIOM愈合的大体观察

在实验的第1、3和5天,小鼠腹腔注射5-FU。在第5天,用高浓度乙酸处理小鼠的舌黏膜以诱导灼伤。到第6天,观察到小鼠舌尖1/3出现溃疡。在每组小鼠的溃疡周围和溃疡中心的5个部位局部注射2.5 μL的PBS或mADSCs细胞悬液(每只小鼠1×106个细胞),见图2A和2B。

图2 小鼠间充质干细胞促进CIOM愈合的大体观察及评分
Fig.2 Gross observation and scoring of CIOM healing promoted by mouse mesenchymal stem cells

A: 小鼠CIOM建模及处理过程示意图;B: 建模后小鼠舌部溃疡形成情况;C: 实验第9、14天小鼠CIOM的大体观察;D: 实验第9、14天小鼠OMI评分;*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1

实验第9天,即移植后第3天,5-FU组溃疡部位出现明显的上皮脱落、显著的红肿;ADSCs组溃疡表面覆盖着一层淡黄色的假膜,有愈合迹象,ADSCs组的溃疡面积明显小于5-FU组,但差异没有统计学意义。实验第14天,即移植后第7天,ADSCs组的溃疡几乎愈合,肉眼观察发现其舌黏膜与对照组相似,无明显异常。而5-FU组的舌前1/3仍呈红色,且舌乳头萎缩,见图2C。根据OMI评分标准,第9天ADSCs组和5-FU组之间差异无统计学意义。ADSCs组和5-FU组的OMI评分均显著高于对照组(均P<0.000 1)。第14天,ADSCs组的OMI评分显著低于5-FU组(P<0.05),5-FU组的OMI评分显著高于对照组(P<0.001),而ADSCs组与对照组之间差异无统计学意义,见图2D。

2.3 mADSCs促进CIOM愈合的组织学观察

H-E染色的结果与大体观察结果一致。在实验第9天,5-FU组和ADSCs组的上皮结构损伤明显,两组之间的组织病理学评分差异无统计学意义。然而,ADSCs组上皮下炎症细胞浸润减少。实验第14天,ADSCs组的上皮形态已基本恢复正常,表现出清晰完整的各层结构,包括角质层、颗粒层、棘层和基底层。相比之下,5-FU组上皮有所恢复,但各层结构仍不清晰,上皮下炎症细胞浸润明显,基底层边界不清晰,见图3A。组织病理学评分显示,实验第9天5-FU组和ADSCs组之间差异无统计学意义。ADSCs组和5-FU组的组织病理学评分均显著高于对照组(P<0.01)。实验第14天,ADSCs组的组织病理学评分显著低于5-FU组(P<0.05);5-FU组的组织病理学评分(P<0.01)显著高于对照组,而ADSCs组与对照组之间差异无统计学意义,见图3B。

图3 小鼠间充质干细胞促进CIOM愈合的组织学观察及评分
Fig.3 Histological observation and scoring of the promotion of CIOM healing by mouse mesenchymal stem cells

A: 实验第9、14天CIOM小鼠舌黏膜的组织病理切片(×200);B: 实验第9、14天舌组织切片的组织病理学评分;*P<0.05,**P<0.01

2.4 mADSCs对CIOM小鼠的炎症因子表达水平的影响

通过qRT-PCR测定不同组小鼠体内促炎细胞因子的mRNA表达水平。结果表明,在实验第9天,与5-FU组相比,ADSCs组的IL-6(P<0.01)和TNF-α(P<0.001)表达水平降低,见图4A。第14天,各组间IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平差异无统计学意义,见图4B。

图4 小鼠促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平比较
Fig.4 Comparison of mRNA expression levels of pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α in mice

A: 实验第9天不同组小鼠中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平;B: 实验第14天不同组小鼠中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.5 mADSCs对CIOM小鼠的Nrf2/Keap1通路及氧化应激反应的影响

采用qRT-PCR检测不同组小鼠舌组织中氧化应激相关因子HO-1、SOD-1、Nrf2和Keap1的mRNA表达水平。结果表明,在第9天,ADSCs组的HO-1(P<0.001)、SOD-1(P<0.000 1)和Nrf2(P<0.05)表达水平显著高于5-FU组,而Keap1表达水平显著低于5-FU组(P<0.05),见图5A。在第14天,5-FU组(P<0.01)和ADSCs组(P<0.001)的HO-1表达水平显著高于对照组;而SOD-1、Nrf2和Keap1的表达水平在各组间无显著差异,见图5B。这些发现表明,mADSCs可能减轻氧化应激,有助于治疗小鼠CIOM。通过免疫组织化学染色以评估不同组小鼠舌组织中氧化应激相关蛋白Nrf2和Keap1的表达水平。结果表明,在第9天,ADSCs组的Nrf2表达显著高于5-FU组(P<0.001),且Keap1表达低于5-FU组(P<0.05)。到第14天,ADSCs组和5-FU组之间的Nrf2表达和Keap1表达均无显著差异,见图5CF。

图5 小鼠氧化应激相关因子HO-1、SOD-1、Nrf2和Keap1的mRNA表达水平及舌组织中Nrf2和Keap1的免疫组织化学分析
Fig.5 Comparison of mRNA expression levels of oxidative stress-related factors HO-1, SOD-1, Nrf2, and Keap1 in mice and immunohistochemical analysis of Nrf2 and Keap1 in mouse tongue tissues

A: 实验第9天不同组小鼠中HO-1、SOD-1、Nrf2和Keap1的mRNA表达水平;B: 实验第14天不同组小鼠中HO-1、SOD-1、Nrf2和Keap1的mRNA表达水平;C: 实验第9、14天不同组小鼠组舌组织中Nrf2的免疫组织化学法染色(×200);D: 实验第9、14天Nrf2免疫组织化学法染色的定量分析;E: 实验第9、14天不同组小鼠组舌组织中Keap1的免疫组织化学法染色(×200);F: 实验第9、14天Keap1免疫组织化学法染色的定量分析;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

3 讨 论

CIOM是化疗常见的副作用,严重影响患者的生活质量。为模拟该疾病,人们提出了多种方法,包括单独使用化疗药物诱导、化疗联合机械刺激以及化疗联合化学刺激。在这些方法中,腹腔内注射化疗药物操作简单,但往往难以诱发稳定且可观察到的口腔黏膜炎或溃疡。静脉注射则较为复杂,且在效果控制方面更具难度。将化疗药物与机械刺激相结合可诱发口腔黏膜炎,但机械刺激难以量化且重复性差,这使得实验稳定性难以保证。相比之下,将化疗药物与化学刺激相结合具有更好的可操作性,能可靠地诱发口腔溃疡,并且溃疡大小可控,能更贴近临床和病理表现。因此,本研究采用5-FU联合乙酸烧灼的方法建立了CIOM的小鼠模型,以确保实验的稳定性和可控性。

在口腔黏膜炎干细胞疗法的动物实验研究中,既往给药途径多采用尾静脉注射实现干细胞的全身性递送[10-11]。尽管这种方法能对多个区域进行系统性治疗,但干细胞可能不会在口腔黏膜中聚集,这可能会限制局部疗效。然而,局部注射能够直接将干细胞输送到受损区域,从而改善局部治疗效果,且全身性副作用少。此外,局部注射操作更简便,更适合临床应用。因此,本研究采用局部注射mADSCs来治疗CIOM,旨在提高局部治疗效果并减少全身副作用。

MSCs因其在组织修复中的再生能力而备受关注[12]。研究表明,MSCs能够减轻化疗引起的组织损伤[13],并且多项研究已证实它们在促进口腔黏膜炎愈合方面的作用[10,14]。有研究发现在三维条件下培养的牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells, GMSCs)比在二维条件下培养的牙龈间质干细胞对CIOM有更强的治疗作用。三维培养的GMSC多能性增强,趋化因子和与细胞迁移和血管生成相关的细胞因子分泌增加,活性氧、氧化诱导因子-1、氧化诱导因子-2α和超氧化物歧化酶水平升高,这有助于对抗氧化应激诱导的细胞凋亡[14]。另有研究发现,扁桃体间充质干细胞(tonsil-derived mesenchymal stem cells, TMSC)黏膜下注射可通过加速新生血管形成和伤口收缩促进口腔黏膜炎创面愈合[15],但GMSC和TMSC的获取有一定的困难,而ADSCs更容易获得,便于临床使用。

虽然已有许多干细胞在组织修复再生中的的研究,但其致瘤性仍是其临床应用中的关键安全性问题。现有研究对此尚未达成共识: 部分证据表明干细胞或祖细胞移植可能会促进肿瘤增殖、血管生成和转移[16-17],然而,亦有研究报道其致瘤潜能较低[18],甚至发现特定类型的干细胞可表现出肿瘤抑制效应[17,19]。本研究采用的ADSCs属于成体干细胞谱系,相较于胚胎干细胞和诱导多能干细胞,其分化潜能受限,因而理论上具有更优的安全性特征[20]。但需特别指出的是,关于自体ADSCs局部注射治疗CIOM的长期致瘤性评估,目前仍缺乏直接临床证据,亟待通过大样本长期随访研究加以验证。

促炎细胞因子在CIOM的发病机制中起着关键作用。研究表明,化疗患者唾液中促炎因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)水平升高与口腔黏膜毒性呈正相关。IL-1β和IL-6水平的进一步升高表明疾病在进展[21]。这些细胞因子的激活在口腔黏膜炎的早期阶段至关重要,因为它们促进活性氧的生成,并激活核因子κB信号通路,进而增强其他促炎细胞因子的表达[22]。在本研究中,qRT-PCR的结果显示,在实验的第9天,小鼠体内诸如IL-6和TNF-α等促炎细胞因子的表达显著降低。这些发现表明,mADSCs可能通过抑制促炎细胞因子的表达来促进CIOM的愈合。

化疗药物通过生成活性氧作用于肿瘤细胞的DNA,从而导致细胞受损和死亡。然而,过量的活性氧也会损害正常细胞的DNA[23-24],导致氧化应激并破坏氧化还原平衡[25]。有研究表明,γ-生育酚能够激活Nrf2/Keap1信号通路,增强清除活性氧酶的表达,降低由5-FU产生的活性氧水平,促进角质形成细胞的生长[16]。此外,研究发现大麻二酚通过Nrf2/Keap1/ARE信号通路减轻5-FU诱导的口腔黏膜炎损伤,其机制在于增加舌上皮厚度、减少活性氧生成、抑制炎症以及促进上皮细胞增殖[17]。其他药物,如格列本脲,也能减轻氧化应激,缓解5-FU所致的口腔黏膜损伤[19]。以上研究提示,氧化应激是5-FU导致口腔黏膜损伤的重要机制,Nrf2/Keap1信号通路是其重要通路之一。本研究发现,在mADSCs治疗的早期阶段,CIOM小鼠的Nrf2基因表达上调,而Keap1表达降低。这些结果表明,mADSCs可能通过Nrf2/Keap1信号通路改善CIOM早期阶段的氧化应激,从而促进黏膜修复。此外,本研究还评估了抗氧化酶HO-1和SOD-1的表达。结果表明,在mADSCs治疗的早期阶段,这两种酶的mRNA表达水平均显著增加。在口腔黏膜炎恢复的后期阶段,5-FU组和mADSCs组的HO-1表达均显著高于对照组,而SOD-1表达则无显著差异。这表明HO-1可能在CIOM的抗氧化反应中发挥长期作用。

本研究采用腹腔注射5-FU溶液联合70%乙酸灼烧舌黏膜建立小鼠CIOM模型,通过局部注射mADSCs,观察到mADSCs能有效治疗小鼠CIOM,其机制可能是通过抑制促炎细胞因子表达和改善氧化应激来实现。未来的研究将进一步利用体外和体内模型探索mADSCs抵抗氧化应激的分子机制,并评估其临床应用的安全性。

利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献说明 李媛媛: 实验设计、实验操作、论文撰写;赵琛: 实验设计、论文撰写与指导;朱平怡: 实验设计、实验操作、数据分析;陈鑫: 数据分析、论文修改;陈佳璐: 论文修改;何园: 研究设计、论文审阅与指导。

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Mechanistic investigation of adipose-derived mesenchymal stem cells in alleviating chemotherapy-induced oral mucositis in mice by activating the Nrf2/Keap1 signaling pathway

LI Yuanyuan*, ZHAO Chen*, ZHU Pingyi, CHEN Xin, CHEN Jialu, HE Yuan

(Department of Endodontics, Stomatological Hospital and Dental School, Tongji University &Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration &Tongji Research Institute of Stomatology, Shanghai 200072, China)

【Abstract】 Objective To investigater the therapeutic effects of mouse adipose-derived mesenchymal stem cells(mADSCs) on chemotherapy-induced oral mucositis(CIOM), along with their potential mechanisms. Methods A mouse CIOM model was established by intraperitoneally injecting 5-fluorouracil(5-FU) and chemically damaging the tongue mucosa with 70% acetic acid, followed by the injection of mADSCs into the ulcerated area. Hematoxylin and eosin(H-E) staining was performed to observe histological changes, while qRT-PCR was used to measure the expression of inflammatory cytokines and oxidative stress-related factors. Immunohistochemical staining assessed the expression of oxidative stress-related proteins. Results After local injection of mADSCs, the ulcer area in the experimental group was reduced compared to the control group on the ninth day of the experiment., along with restoration of the epithelial structure, decreased inflammatory cell infiltration, and lowered expression of interleukin-6(IL-6), and tumor necrosis factor-α(TNF-α), indicating therapeutic effects on CIOM. Additionally, treatment with mADSCs resulted in elevated expression of oxidative stress-related factors heme oxygenase 1(HO-1), superoxide dismutase 1(SOD-1), and Nuclear factor(erythroid-derived 2) -like 2(NFE2L2)(Nrf2) in the lesions, while Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1) expression decreased, indicating that these therapies may alleviate oxidative stress through the Nrf2/Keap1 signaling pathway in the treatment of CIOM. Conclusion This study provides preliminary insights into the roles and mechanisms of mADSCs in treating chemotherapy-induced oral mucositis, offering a theoretical foundation for new treatment strategies for CIOM.

【Key words】 chemotherapy-induced oral mucositis; 5-fluorouracil; mesenchymal stem cells; oxidative stress

收稿日期：2025-04-26

录用日期：2025-06-20

基金项目：国家自然科学基金(82170961,82370970)

作者简介：李媛媛(1999—),女,硕士研究生,E-mail: 1443837324@qq.com;赵 琛(1989—),女,主治医师,博士,E-mail: tjkqnm@163.com;*为共同第一作者

通信作者：何 园,E-mail: drheyuan@tongji.edu.cn

DOI：10.12289/j.issn.2097-4345.25172

【中图分类号】 R781.5

【文献标志码】 A

【文章编号】 2097-4345(2025)06-0819-09