DOI:10.12289/j.issn.2097-4345.25115
中图分类号:R692.5
艾力亚尔·艾尼瓦尔1,2,3， 孙淑雯4， 阿依努尔·伯合提亚尔5， 张竞成1,2， 蒋宇峰1,6， 鄢阳1,2
| 【作者机构】 | 1同济大学医学院； 2同济大学附属第十人民医院泌尿外科； 3新疆维吾尔自治区喀什地区第二人民医院泌尿外科； 4徐州医科大学； 5新疆维吾尔自治区喀什地区第一人民医院肾病中心； 6同济大学附属第十人民医院崇明分院泌尿外科 |
| 【分 类 号】 | R692.5 |
| 【基 金】 | 上海市崇明区“可持续发展科技创新行动计划”(CKY2023-47) |
·基础研究·
顺铂(cisplatin, CIS)是首个基于金属的化疗药物,并广泛用于膀胱癌、睾丸癌、卵巢癌、肺癌、宫颈癌、头颈部癌症、胃癌等多种癌症的化疗[1]。顺铂的抗癌机制主要是与基因组DNA或线粒体DNA结合,导致DNA损伤,阻止DNA复制,阻断DNA复制和转录,抑制下游的蛋白质的产生,激活多个引起细胞坏死或凋亡的转导途径导致细胞死亡[2]。
顺铂主要毒副作用包括肾毒性、肝毒性、生殖道毒性和神经毒性等[1]。化疗后90%以上的顺铂通过肾排泄,并由于肾小管对顺铂聚集作用,导致顺铂对肾脏的毒性尤为明显,因此肾小球滤过率大小是能否选择顺铂化疗的决定因素之一[3]。据报道,接受单一剂量(50 mg/m2体表面积)顺铂化疗的患者中,有28%
36%的患者出现急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)[4]。肾功能减退可能使患者面临更换化疗药物等情况,因此研究减轻顺铂引起的肾毒性的药物,对提高顺铂的抗肿瘤的剂量以及发挥顺铂应有的抗肿瘤作用,具有十分重要的意义[5]。
红景天苷(salidroside, SAL),又称红景天甙,是从景天科植物红景天中提取的苷类化合物,具有广泛的药理作用和临床应用价值。据报道,SAL具有抗氧化与延缓衰老、心血管保护、免疫调节[6]。此外,红景天苷在多个肿瘤相关研究中,表现出抗恶性肿瘤、化疗增敏等作用[7-8]。但其对顺铂肾毒性的保护作用尚未见报道。
本研究通过体内、外实验探索SAL抑制CIS-AKI的作用及机制,为寻找CIS-AKI的治疗策略提供新的理论依据。
顺铂(CAS: 15663-27-1)购自MedChemExpress(MCE)公司,SAL(CAS: 10338-51-9,纯度≥98%)购自成都曼思特生物科技有限公司,DMEM/F-12培养基、100×链霉素和青霉素、蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自武汉赛维尔生物科技有限公司,DHE染色试剂盒、TUNEL荧光检测试剂盒、RIPA购自上海碧云天生物技术有限公司。肌酐和尿素氮试剂盒购自南京建成生物。抗氧化酶检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutas, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-px)试剂盒购自南京建成生物。siRNA阴性对照(si-NC)和靶向EFNA1的siRNA均购自Genomeditech。INTERFERin转染试剂购自Polyplus。
1.2.1 细胞培养 人肾小管上皮细胞系(HK-2)购自美国生物标准品资源中心(American Type Culture Collection, ATCC)。在DMEM/F-12完全培养基中添加10% FBS和1% 100×链霉素和青霉素,37 ℃含5% CO2的细胞培养箱中培养。
1.2.2 体外模型的建立 将20 mg红景天苷和20 mg顺铂分别溶解于1 mL灭菌PBS及2 mL N,N-二甲基甲酰胺中配制母液,使用完全培养基稀释母液至所需的具体浓度(顺铂: 0、5、10、15、20、25、30、35、40 μmol/L;SAL: 0、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L)。用96孔板,以5×103/孔的细胞浓度铺板并培养过夜。浓度梯度的SAL处理HK2细胞24 h后用CCK8检测细胞活性。同样方法铺板后,按浓度梯度的顺铂处理细胞,24 h后检测细胞活性。选定合适的药物浓度后,用SAL处理HK2细胞24 h,再用顺铂和SAL共同处理24 h后检测细胞活性,确定SAL的保护作用。
1.2.3 动物模型的建立 18只810周龄C57BL/6雌性小鼠,体质量2025 g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。小鼠在恒温、恒湿昼夜交替的标准环境中喂养。小鼠随机分为三组: 正常阴性对照组(NC)、模型组(CIS)和治疗组(CIS+SAL)。CIS+SAL组的小鼠从第110天每日腹腔注射SAL(100 mg/kg)[9],并在第8天腹腔注射顺铂(20 mg/kg)[10]。CIS组小鼠从第110天每日腹腔注射等量的生理盐水,第8天腹腔注射CIS(20 mg/kg)。NC组的小鼠每天腹腔注射与实验组等量的生理盐水。所有小鼠在注射顺铂72 h后麻醉并经眼球取血后脱颈处死,于超净台收集双侧肾脏。一侧肾脏用4%多聚甲醛固定后用于病理学检查,另一侧肾用于其他分子生物学实验。
1.2.4 CCK8实验 用细胞计数试剂盒(CCK8)评估细胞活力和数量。将HK-2细胞接种到96孔板中,以5×103/孔的细胞浓度完铺板并培养过夜,用根据实验设计用药物刺激(药物浓度见结果部分)。为测定细胞活性,从96孔板中吸出培养基,用灭菌PBS冲洗细胞2次,将培养基和CCK8试剂按9∶1的比例混合后,每孔加入100 μL并孵育14 h,然后用酶标仪测量450 nm处的光密度值(D450)。
1.2.5 Western印迹实验 使用RIPA裂解细胞和肾组织,并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂,离心去除细胞碎片。另取适量肾组织用核和细胞质蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白。用BCA检测试剂盒定量检测上清液的蛋白质浓度。经SDS-PAGE凝胶电泳处理后,一抗[Bcl-2(1∶1 000),BAX(1∶1 000),GAPDH(1∶50 000),EFNA1(1∶1 000),Nrf2(1∶1 000),AKT(1∶2 000),p-AKT(1∶500),NGAL(1∶1 000),Cleaved Caspase 3(1∶1 000),PI3K(1∶1 000),p-PI3K(1∶500)]孵育过夜。第2天用对应的HRP结合的二抗[山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)或山羊抗鼠IgG HRP(1∶5 000)在室温下孵育1 h。结束后经发光成像系统显像。每张膜均以GAPDH为内参,目标蛋白/GAPDH灰度值为相对表达量。
1.2.6 病理检测 对于肾组织切片进行过碘酸希夫(PAS)染色,并进行肾小管损伤评分定量。另取切片脱蜡和复水后,使用Bcl-2(1∶500)、BAX(1∶500)和NGAL(1∶600)抗体对切片进行免疫组织化学染色。另外用荧光检测试剂盒检测TUNEL荧光。
1.2.7 肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)检测 提取小鼠血清后再根据生产商提供的说明使用市售试剂盒进行血尿素氮和血肌酐的测定。
1.2.8 DHE染色 DHE染色用于检测HK2细胞中ROS的水平。在室温下,用20 μmol/L DHE溶液避光孵育细胞爬片30 min,然后用DAPI染色。封片后荧光显微镜下观察图像并记录。
1.2.9 流式细胞检测 用不含酚红的胰蛋白酶消化细胞后,用PI-Annexin V-FITC试剂盒根据说明对细胞进行染色,接着进行流式细胞仪检测。
1.2.10 抗氧化酶检测(SOD、CAT、GSH-px) 按照试剂盒说明,蒋HK2细胞PBS清洗并收集后用PBS重悬并在冰浴中用超声充分破碎,离心后留取上清液用于上机检测。按说明称精确取一定量肾组织后PBS中匀浆后离心留取上清液并用于检测。
1.2.11 透射电子显微镜检测 将HK2细胞置于专用固定液中后在4 ℃条件下固定2 h。将组织切成超薄切片(6080 nm)后,用醋酸铀和柠檬酸铅染色,然后用TEM(HT7800,HITACHI)检测。
1.2.12 转录组测序(RNA-seq) 将CIS+SAL及CIS组细胞各三组用于提取总RNA,通过Agilent2100对RNA完整性进行检测,利用NanoDrop精确测定RNA的浓度。后续测序操作由和元生物完成。Sangerbox3.0在线分析工具用于辅助分析及绘制图形。
1.2.13 siRNA转染 当细胞融合率达到约70%时,使用INTERFERin转染试剂转染50 nmol/L的EFNA1siRNA。EFNA1 siRNA序列: 5′-AAUACU-GACCCUGUUUGAGGC-3′,阴性对照(si-NC): 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。
1.2.14 免疫荧光检测 用4%多聚甲醛固定HK2细胞爬片,用3%牛血清白蛋白封闭。在4 ℃下用抗Nrf2抗体免疫染色过夜。用山羊抗兔二抗孵育切片1 h。然后在荧光显微镜下采集染色切片的图像。
利用Graphpad 10.0统计制图学软件对RT-qPCR和WB结果进行统计分析。两组之间比较采用非配对t检验,多组数据用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
分别测定顺铂和SAL对HK2细胞的作用。根据结果,顺铂实验浓度选定较接近50%存活率的10 μmol/L。为探索不同浓度SAL对HK2细胞的作用,本研究分别用0、10、20、30、40、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L浓度的SAL处理HK2细胞,发现100 μmol/L浓度的SAL对细胞活性的促进作用最强,大于150 μmol/L后出现细胞毒性,见图1A、1B。在10 μmol/L顺铂刺激条件下,SAL在40100 μmol/L浓度范围内的保护作用呈浓度依赖性,100 μmol/L时保护作用最显著,之后便逐渐减弱,150 μmol/L之后出现细胞毒性,见图1C。证明SAL可以降低顺铂对HK2细胞毒性作用,为获得最显著的差异,在后续实验中使用10 μmol/L的顺铂及100 μmol/L的SAL为最佳药物浓度。
图1 顺铂和SAL对HK2细胞作用
Fig.1 Effect of cisplatin and SAL on HK2 cells
A: 顺铂对HK2细胞的影响;B: SAL对HK2细胞的影响;C: SAL对顺铂处理的HK2细胞的保护作用;*P<0.05,**P<0.01
该浓度下,顺铂明显升高中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin, NGAL)蛋白表达水平(图2A、2B),SAL预处理使肾损伤标志物表达水平明显降低。
图2 Western印迹法分析HK2细胞NGAL
Fig.2 Expression of NGAL in HK2 by Western blotting
A: NGAL蛋白水平;B: NGAL相对定量结果;***P<0.001
在小鼠CIS-AKI模型中,测定小鼠血清中BUN及肌酐Cr水平、小鼠体质量、病理结果、肾损伤标志物水平等生化指标评估AKI严重程度。结果显示,CIS组小鼠血清BUN和Cr水平明显高于CIS+SAL组(图3A、3B)。
图3 小鼠血清肌酐及尿素氮结果
Fig.3 Results of serum creatinine and blood urea nitrogen in mice
A: 血清肌酐;B: 血尿素氮;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
图4 Western印迹法分析小鼠肾组织的NGAL水平
Fig.4 Western blotting analysis of NGAL in mice renal tissue
A: NGAL蛋白水平;B: NGAL相对定量结果;**P<0.01,***P<0.000 1
从小鼠肾组织提取总蛋白质,检测NGAL表达水平。结果显示,CIS+SAL组的小鼠肾损伤标志物水平显著低CIS组。
在肾组织病理检查中,小鼠肾组织石蜡切片PAS染色用于观察镜下肾小管损伤情况,石蜡切片NGAL组化用于评估肾损伤标志物表达。PAS染色结果显示,与NC组相比,CIS组可见严重的肾小球萎缩(G,红色箭头)、近端肾小管刷状缘脱落(P,绿色箭头)、肾小管上皮细胞损伤和脱落(黄色箭头)以及肾小管内的管型形成(蓝色箭头),但在CIS+SAL组,损伤程度较CIS组轻。肾组织切片H-E染色后,根据刷状缘的缺失、肾小管扩张、管型形成、肾小管坏死和中性粒细胞浸润程度将肾小管损伤分为05,共6级。随机选择10个高倍视野,其中5个位于肾皮质,5个位于皮质-髓质交界处。每个视野从0到5进行评分。0: 正常;1: 轻度损伤,涉及0% 10%;0: 正常;1: 轻度损伤,涉及0% 10%;3: 重度损伤,涉及26%49%;4: 高度重度损伤,涉及50% 75%;5: 广泛损伤,涉及>75%。在对肾小管损伤评分进行量化后,可以看出SAL治疗减轻了顺铂诱导的小鼠肾小管损伤程度,见图5A、5B。
图5 小鼠肾组织PAS染色和NGAL免疫组织化学法染色
Fig.5 PAS staining and NGAL immunohistochemistry of mouse kidney tissue
A: 肾组织PAS染色及NGAL免疫组织化学法染色;比例尺: 100 μm,红色箭头: 肾小球萎缩,绿色箭头: 肾小管刷状缘脱落,蓝色箭头: 肾小管内的管型;B: 小鼠肾小管损伤评分定量;**P<0.01,***P<0.001
氧化应激和ROS积累是顺铂引起的AKI的重要标志。DHE染色和流式细胞术检测HK2细胞ROS水平,可见CIS组ROS阳性细胞比例最高,CIS+SAL组低于CIS组,见图6。
图6 HK2细胞DHE染色流式细胞术检测结果
Fig.6 Flow cytometric results of DHE staining of HK2 cells
ROS的积累还能导致抗氧化酶的消耗,CIS组HK2细胞和肾组织中SOD、GSH-px、CAT水平显著降低,CIS+SAL组中抗氧化酶的水平较CIS组显著升高,见表1、2。
表1 HK2细胞抗氧化酶水平
Tab.1 Antioxidant levels of HK2 cells (U/mg)
项目NC组CIS组CIS+SAL组SOD15.03±1.708.85±1.31∗12.53±0.74#CAT93.64±3.6954.17±4.93∗72.45±5.50#GSH-px52.12±2.0930.22±1.73∗38.69±2.01#
与NC组相比,*P<0.05;与CIS组相比,#P<0.05
表2 小鼠肾组织抗氧化酶水平
Tab.2 Antioxidant levels of mice renal tissue (U/mg)
项目NC组CIS组CIS+SAL组SOD12.69±1.175.35±0.81∗8.45±1.19#CAT48.47±3.1527.38±1.75∗36.95±4.98#GSH-px37.32±4.7820.51±1.89∗26.96±3.10#
与NC组相比,*P<0.05;与CIS组相比,#P<0.05
透射电镜观察显示,CIS组HK2细胞出现明显的线粒体肿胀(红色箭头)、线粒体嵴断裂和破坏(黄色箭头)、线粒体膜破裂(绿色箭头)等情况,这些变化在CIS+SAL组得到缓解,见图7。可见SAL起显著的保护线粒体作用。
图7 HK2细胞线粒体透射电镜图
Fig.7 Transmission electron microscopy of HK2 cell mitochondria
红色箭头: 线粒体肿胀;绿色箭头: 线粒体膜破裂;黄色箭头: 线粒体嵴断裂和破坏;比例尺: 500 nm
为检测HK2细胞和小鼠肾组织中凋亡相关指标,BAX免疫组化和TUNEL荧光检测肾组织切片的Bcl-2水平,以及HK2细胞的Bcl-2、BAX及Cleaved Caspace 3的蛋白水平。Western印迹法提示,CIS组的Bcl-2/BAX比值较NC组显著降低,CIS+SAL组中较CIS组升高。Cleaved Caspace 3在CIS组中最高,CIS+SAL组中较CIS组显著下降,见图8AC。与对照组相比,CIS组肾组织中Bcl-2表达明显下降,凋亡蛋白BAX表达升高,TUNEL荧光最强,见图8D。与CIS组相比,CIS+SAL组中Bcl-2有所升高,BAX下降,TUNEL荧光也有所减弱。该结果提示,CIS组细胞凋亡水平最高,CIS+SAL组低于CIS组。
图8 Western印迹法和免疫组织化学法、荧光检测HK2细胞及小鼠肾组织凋亡蛋白
Fig.8 Validation of apoptosis in HK2 cells and mouse kidney tissue by Western blotting and immunohistochemistry and fluorescence
A: Western印迹法检测HK2细胞不同蛋白表达;B: 三组Bcl-2/BAX相对定量比较;C: 三组Cleaved Caspase 3相对定量比较;D: 免疫组织化学法及TUNEL荧光检测三组小鼠肾组织不同蛋白表达;比例尺: 100 μm;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.000 1
为探究SAL的作用机制,对CIS+SAL和CIS组HK2细胞进行RNA-seq测序分析。根据差异倍数及显著性(|log2FC|>1,P<0.05)绘制火山图。共有70个基因表达升高,有83个基因表达降低,见图9A,其中EFNA1的差异倍数最大(log2FC=4.501,P<0.05)。因此,本研究认为EFNA1可能为SAL发挥作用的关键基因。
图9 测序数据分析结果
Fig.9 Results of the sequencing data analysis
A: CIS+SAL与CIS高表达数据火山图;B: KEGG富集分析;C: GO分析富集分析
为寻找使用SAL后富集的通路,对表达升高的基因进行KEGG富集和GO分析。KEGG富集分析结果中,有PI3K/AKT信号通路、Rap1信号通路、长寿调节通路、Ras信号通路、FOXO信号通路等通路显著富集,见图9A、B;在GO富集结果中,有凋亡过程负调控、程序性死亡的负调控、PI3K信号的正调控等生物学过程显著富集,图9C,提示上述通路在使用SAL后可能被激活。
使用EFNA1 siRNA转染HK2细胞,并通过RT-qPCR及Western印迹法验证敲低效果,见图10AC,挑选敲低效率最高的siRNA3用于后续实验,将敲低组细胞记为KD组,将阴性对照组记为si-NC组。CCK8实验结果表明,当敲低EFNA1后,SAL的保护作用明显减弱,见图10D。
图10 siRNA转染HK2细胞效果比较
Fig.10 Transfection of HK2 cells with siRNA
A: RT-qPCR验证转染效果;BC: Western印迹法验证转染效果;D: HK2细胞CCK8结果;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
Nrf2是SOD、GSH-px、CAT等抗氧化酶的重要转录因子之一。免疫荧光显示,正常状态下Nrf2主要位于细胞质中,在si-NC组和EFNA1敲低组内,CIS组中Nrf2荧光强均比各自的NC组低,顺铂降低细胞内Nrf2的表达量的同时会抑制其核转位。各组的CIS+SAL组中细胞核内荧光强度均高于CIS组,说明SAL的使用增强了Nrf2的入核,并使SOD、CAT、GSH-px转录升高。CIS+SAL组的细胞核内Nrf2荧光明显低于CIS+SAL组,抗氧化酶的水平也无显著增加,见图11,说明EFNA1的敲低间接抑制SAL对Nrf2入核的作用。
图11 HK2细胞抗氧化酶水平及Nrf2免疫荧光
Fig.11 HK2 cell antioxidant enzyme levels and Nrf2 immunofluorescence
A C: HK2细胞SOD、CAT、GSH-px水平;HK2细胞Nrf2免疫荧光;比例尺: 50 μm
图12 WB验证SAL对EFNA1和PI3K/AKT/Nrf2的影响
Fig.12 Western boltting validation of the effect of SAL on EFNA1 and PI3K/AKT/Nrf2
A: 敲低前后细胞内EFNA1、NGAL、PI3K/AKT/Nrf2各蛋白的水平;B E: 不同蛋白相对表达量;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
Western印迹法检测EFNA1及PI3K/AKT/Nrf2信号通路相关蛋白显示,顺铂可使HK2细胞NAGL表达水平升高,并在CIS+SAL组显著下降;EFNA1敲低后,NGAL水平在CIS+SAL组和CIS组的差异不显著;EFNA1敲低后,CIS+SAL(KD)组中p-PI3K、p-AKT在较CIS+SAL(si-NC)明显下降,说明SAL对PI3K和AKT的磷酸化作用在EFNA1敲低后显著下降,SAL对NGAL的抑制作用也在EFNA1敲低后减弱。提取细胞核蛋白后使用Western印迹法检测细胞核内Nrf2(nu-Nrf2)的变化,顺铂诱导后细胞核内的Nrf2水平显著下降,SAL增加顺铂诱导后细胞核中Nrf2的水平;EFNA1敲低后,SAL促进Nrf2入核的作用被显著抑制。
为验证小鼠体内实验中SAL对CIS-AKI的作用,分别提取小鼠肾组织的总蛋白、核蛋白,通过Western印迹法试验验证PI3K/AKT/Nrf2通路的影响。顺铂刺激后EFNA1、p-PI3K及p-AKT化水平及细胞核内Nrf2均降低,与CIS组相比,在CIS+SAL组中p-PI3K及p-AKT降低,Nrf2核定位也随之减少,见图13。可总结为SAL通过上调EFNA1激活PI3K/AKT信号通路,促进Nrf2入核,促进抗氧化酶的转录,提高细胞抗氧化应激水平,减轻细胞氧化应激损伤,从而抑制顺铂诱导的细胞凋亡,见图14。
图13 Western印迹法验证小鼠肾组织EFNA1及PI3K/AKT/Nrf2信号通路
Fig.13 Western boltting validation of EFNA1 and PI3K/AKT/Nrf2 signaling pathways in mice renal tissue
A: EFNA1和PI3K/AKT/Nrf2各蛋白的水平;B E: 不同蛋白相对表达量;*P<0.05,***P<0.001
图14 SAL对CIS-AKI的作用机制图
Fig.14 Mechanism diagram of effect of SAL on cisplatin-induced acute kidney injury(CIS-AKI)
SAL通过上调EFNA1激活PI3K/AKT通路,促进Nrf2入核,增加抗氧化酶转录,从而发挥保护作用
线粒体功能障碍、细胞内氧化应激和ROS积累是CIS-AKI的标志,也是CIS-AKI重要机制之一[11]。线粒体是ROS的一个重要来源,在细胞应激或其他刺激(如顺铂)的作用下,线粒体功能受抑制,线粒体产生ROS的显著增加,如果过量的ROS无法被中和,就会出现氧化应激,影响多种信号通路(包括PI3K、Nrf2和铁死亡等),最终导致DNA损伤和细胞死亡[12-14]。研究显示,促进线粒体生物合成、增强线粒体动力学或增加内源性抗氧化剂等过程,可以减少CIS-AKI中的氧化应激和细胞凋亡[15]。顺铂可直接或间接影响线粒体功能,在胞吞作用下,顺铂被水解成带正电荷的分子,直接破坏线粒体复合物,导致ROS增加,产生氧化应激,促使细胞凋亡[16]。这些使得抗氧化治疗成为CIS-AKI模型治疗干预的热门选择[17]。具有抗氧化作用的化合物SAL对顺铂肾毒性的保护作用尚未见报道。
SAL可通过抑制活性氧和氧化应激,减轻氧化应激诱导的细胞和组织损伤[18]。Shati等[19]研究发现,T1DM成年雄性Wister大鼠用SAL治疗8周后,可改善肾脏结构,降低肾脏ROS、空腹血糖水平,增加SOD和GSH-px,并抑制肾纤维化。在Yang等[20]的小鼠肾纤维化模型中,对SAMP8小鼠用SAL给药12周后,SAL组血尿素氮和血清肌酐升高水平显著低于对照组。Sun等[21]发现,在缺血/再灌注条件下,SAL通过影响TLR4/NF-κB途径降低HK-2细胞的ROS水平,并提高SOD活性,从而提高缺血/再灌注后的HK-2细胞的存活率。在多项研究中,SAL还表现出抗肿瘤[8,22-23]、化疗增敏[24]等特性。
EFNA1是Ephrin家族的成员,它通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜,主要通过与EphA2受体结合,介导细胞间双向信号转导,参与多种生理和病理过程[25]。EFNA1可引起EphA2受体聚集和酪氨酸磷酸化,从而导致EphA2的寡聚化和激活[26],激活后的EphA2受体募集并激活PI3K,催化生成PIP3,PIP3激活PDK1,PDK1促进AKT的磷酸化,从而激活下游信号通路[27]。
本研究的KEGG分析结果显示,PI3K/AKT信号通路的显著性最高,另外长寿调节等下游通路也有富集,并且PI3K/AKT与EFNA1的功能联系较为密切。因此,本课题组假设SAL通过EFNA1影响PI3K/AKT/Nrf2通路,随后经体内外实验的结果也验证了这个猜想。此外,在KEGG分析中,能观察到HIF1、AMPK、长寿调节等信号通路富集,这可能与PI3K/AKT激活影响下游的通路或者Nrf2促进其他抗氧化相关基因有关,或者可能还有上述信号通路协同参与SAL的作用机制。在多种疾病模型中,SAL影响HIF1、AKPK、铁死亡、MAPK、Wnt1/3a/β-catenin、Nrf2等信号通路[18,28-30]。上述通路与细胞的抗氧化、细胞存活、能量代谢、细胞稳态等活动关系密切。根据既往研究,多种因素可改变EFNA1的表达,如EFNA1在低氧处理的细胞系中显著上调,缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α都介导缺氧诱导的EFNA1表达。因此,在本研究中SAL的作用也有可能通过HIF或者其他途径影响EFNA1的表达,其背后的这些机制需要进一步的研究来证明[25]。
PI3K/AKT是细胞存活、增殖、代谢和抗凋亡的核心调控者,激活后可促进葡萄糖摄取、糖酵解和脂质合成,PI3K/AKT通路可间接调控Nrf2的定位,促进其入核[31]。Nrf2是一种关键的转录因子,能够激活一系列参与抗氧化反应的细胞因子,进而编码多种抗氧化酶[32],增强细胞的抗氧化防御,减少氧化损伤,并缓解代谢失调和炎症,这些都是导致细胞损伤和衰老的关键因素[33]。在正常状态下,Nrf2与Keap1结合形成复合物,通过泛素化降解维持低水平,氧化应激下,Keap1失活,Nrf2稳定并转位至细胞核[34]。根据顺铂毒性相关的研究,顺铂不仅能抑制Nrf2入核,而且还抑制Nrf2的转录水平[35],这也是顺铂引起氧化损伤的机制之一。PI3K激活后,其下游效应激酶AKT可使Nrf2磷酸化,增强Nrf2的稳定性并促进其入核[36]。磷酸化激活后的Nrf2更易与Keap1解离,从而避免被降解。Nrf2激活后,核定位信号暴露,促进Nrf2与核转运蛋白结合,加速向核内运输。AKT激活可通过调控CRM1活性,减少Nrf2出核,延长核内停留时间[37]。PI3K/AKT还可与MAPK(如ERK、JNK)通路协同刺激,通过多重磷酸化过程增强Nrf2的活性和核定位[38-39]。本研究通过实验免疫荧光及Western印迹法检测Nfr2和定位变化并验证SAL通过上调EFNA1激活PI3K/AKT信号通路,促进Nrf2入核,从而促进抗氧化酶的转录,提高细胞抗氧化应激水平,减轻细胞氧化应激损伤,抑制顺铂诱导的细胞凋亡。
综上所述,本研究发现,SAL可通过上调EFNA1激活PI3K/AKT/Nrf2信号通路,促进Nrf2入核,促进抗氧化酶的转录而抑制氧化应激,最终减轻CIS-AKI。
利益冲突声明 所有作者声明不存在利益冲突。
作者贡献说明 艾力亚尔·艾尼瓦尔: 设计与构思、实验操作、数据收集与分析、论文撰写;孙淑雯: 设计与构思、论文润色;阿依努尔·伯合提亚尔: 设计与构思、论文润色;张竞成: 论文撰写、润色、实验操作、数据收集;蒋宇峰: 论文指导、提供研究经费;鄢阳: 研究项目指导与监督、论文审核、提供研究经费。
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